用于调控植物花期的基因、重组载体及应用制造技术

本发明专利技术属于植物生长领域，涉及调控植物花期、抗病性的基因，特别是指用于调控植物花期的基因、重组载体及应用。本课题组在抗病育种的研究过程中，克隆了一个本氏烟的NBS

【技术实现步骤摘要】
用于调控植物花期的基因、重组载体及应用


[0001]本专利技术属于植物生长领域，涉及调控植物花期的基因，特别是指用于调控植物花期的基因、重组载体及应用。

技术介绍

[0002]植物开花受到包括光周期、内源激素等在内多种内在因素和外部环境的影响。花期是影响烟草生育期长短、决定烟草有效叶片数的关键因素之一，是开花植物生命周期中的一个重要环节，它标志着植物由营养生长转变为生殖生长。花、果实、种子是多种农作物的主要产品，因此，成花决定了农作物的上市时间和经济价值。植物经过长期的选择进化，形成了一套复杂而精细的调控网络来响应各种内、外源信号(如光周期、温度、年龄、赤霉素等)，从而调控开花，以使植物能在最佳时间开花。
[0003]花期调控是根据植物的开花习性与生长发育规律，人为地改变植物的外界环境或通过生物技术改变植物的基因或内部组分，实现提前或延迟开花。通花期调控，提高植物的经济价值。应用花期调控技术，可以使早花果树免受或者少受早春晚霜冻害；也可以使蔬菜、水果、花卉及农作物反季供应，如冬季的黄瓜、番茄、草莓等。此外，对于杂交育种工作，花期控制技术可以使原本花期不遇的杂交亲本在同一时期内开花，解决杂交授粉在时间上的矛盾，有利于育种工作的开展，植物花期调控具有重要的农业与经济价值。专利202110374691.1公开了一种延迟百合花期的转录因子LbNAP，通过降低LbNAP转录因子的表达量，以延长植物花期，构建基于烟草脆裂病毒TRV的包含LbNAP转录因子基因片段的病毒诱导基因沉默载体；专利201911317235.2公开了与烟草低温早花相关基因NtDUF599，该基因在低温胁迫下实现开花周期的提前；关于缩短植物开花周期的基因一直是育种工作的研究热门，通过诱导花期提前等方式缩短种质材料的生育期，进而实现一年多代、提高育种效率，是本课题组的研究方向。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提出一种用于调控植物花期的基因、重组载体及应用。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：本申请在在抗病育种的研究过程中，克隆了一个本氏烟中的NBS
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LRR类基因NbLOV1，序列如SEQ ID No.1所示。生信分析结果表明，该基因与植物对真菌病原的响应密切相关，在通过基因编辑、敲除该基因验证基因功能的实验中发现，敲除NbLOV1后，本氏烟现蕾、开花时间比对照明显提前。
[0006]一方面，本申请请求保护一种用于调控植物花期的基因，所述基因为含有核苷酸结合位点和富含亮氨酸重复序列的蛋白质。
[0007]进一步，所述基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]编码上述基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0009]以上述基因为靶基因的重组载体。
[0010]优选的，所述重组载体为基于CRISPR的基因编辑重组载体。
[0011]进一步，所述重组载体为pORE
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Cas9编辑载体或pDC45编辑载体。
[0012]上述的重组载体在缩短植物花期中的应用。
[0013]上述的重组载体在培育一年多代新品种中的应用。
[0014]上述的重组载体在增强植物抗镰刀菌病害中的应用。
[0015]所述应用步骤如下：将重组载体通过农杆菌介导的遗传转化技术，转入样本植物中制备花期缩短和/或抗抗镰刀菌病害品种。
[0016]优选的，所述植物为烟草。
[0017]进一步，所述植物为本氏烟草。
[0018]本专利技术具有以下有益效果：1、本申请新发现的基因NbLOV1，不仅是响应病害相关的基因，还可以通过敲除该基因实现缩短开花周期，本申请创制的基因编辑阳性株系的抗病性与对照相比出现了明显的差异，经过构建的敲除NbLOV1基因重组载体转染的烟草植株呈现对镰刀菌的强抗性：仅叶色略发黄、轻度萎蔫，而对照的烟草则出现维管束损坏、叶面出现较严重的萎蔫、有坏死斑。
[0019]2、利用本申请的方法敲除NbLOV1基因的新植株与对照相比花期明显提前，在同样的培养条件下，对照的本氏烟需要长至将近20片叶、株高20余厘米以上，才现蕾开花，而NbLOV1基因编辑的突变体，在仅有叶片数少于10片，仅10余厘米时，就会现蕾开花，开花周期缩短了一半左右。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1为NbLOV1基因CDS区的电泳胶图。
[0022]图2为NbLOV1基因的结构示意图。
[0023]图3为基因编辑载体的PCR扩增及测序验证结果，其中A.PCR电泳图，M为DL2000 marker；1，2，3分别为P1菌株中的Cas9、U26和gRNA片段；B.构建的载体中sgRNA的靶位点序列与原载体序列比对高亮显示的为靶位点序列。
[0024]图4为通过PCR扩增的阳性植株电泳图，其中，M为DL2000 marker；1
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11依次为NbLOV5、NbLOV
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6、NbLOV
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8、NbLOV9、NbLOV
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10、NbLOV11、NbLOV15、NbLOV20、NbLOV28、NbLOV31、NbLOV45的条带；12为阳性对照，13为阴性对照。
[0025]图5为在相同培养条件下，基因编辑阳性株系与对照株系现蕾期的实物图。
[0026]图6为NbLOV28、NbLOV31的基因编辑结果图，其中，下划线部分为靶位点、红色为编辑的结果。
[0027]图7为盆栽条件下现蕾期的对照图。
[0028]图8为蛋白结构的生信分析图。
[0029]图9为叶柄浸入粗毒素后不同品种叶片的状态图，其中左侧为野生型，右侧为抗性植株NbLOV1。
[0030]图10为接种镰刀菌后30天的烟草植株实物图，左侧为NbLOV1（突变体）植株，表现为抗病；右侧为野生型对照，表现为感病。
具体实施方式
[0031]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0032]实验材料与试剂耗材本氏烟种子由中国农业大学李大伟教授惠赠。无菌苗培养于本单位重点实验室的光照培养箱中。
[0033]培养基成分为2.2g/LMS 基础盐、20g/L蔗糖、Gamborg's维生素成分，8g/L琼脂。培养条件为16小时光照、8小时黑暗，温度设置为25
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28℃。
[0034]pORE
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于调控植物花期的基因，其特征在于：所述基因属于含有核苷酸结合位点和富含亮氨酸重复序列的蛋白质。2. 根据权利要求1所述的用于调控植物花期的基因，其特征在于：所述基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3. 编码权利要求1或2所述的基因，其核苷酸编码序列如SEQ ID No.1所示。4.含有权利要求3所述的基因的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为基于CRISPR基因编...

【专利技术属性】
技术研发人员：平文丽，李雪君，孙计平，孙焕，李旭辉，俎焕新，侯咏，张雪珂，耿胜娜，
申请(专利权)人：河南省农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：