盐生草Hg50329基因在排钠离子中的应用制造技术

本发明专利技术提供了盐生草Hg50329基因及其调控Na

【技术实现步骤摘要】
盐生草Hg50329基因在排钠离子中的应用


[0001]本专利技术属于植物生物工程和转基因
，具体涉及盐生植物盐生草耐盐基因Hg50329及其调控Na
+
外排方面的应用。

技术介绍

[0002]土壤盐渍化已成为限制全球粮食生产的主要因素之一。据估计，全世界5.2亿hm2的旱作耕地中就有3.6亿hm2正在遭受水土流失、土壤退化和盐渍化的危害，50％的可灌溉耕地(2.3亿hm2)同样受到盐渍化影响
[1]。全球每年农业生产中因土壤盐渍化造成的损失高达120亿美元，我国当前盐渍化土壤面积约3600多万hm2，且呈现出不断增长的趋势
[2]。
[0003]盐胁迫抑制植物生长有两个阶段：首先，盐离子逐渐积累不仅对叶片的生长产生抑制作用，同时根系伸长区与成熟区的细胞分裂与分化会受到严重影响，进而抑制植物根系的生长
[3]，在植物生长的早期阶段植物根系受渗透效应的影响，使植物体内缺水形成生理干旱，阻碍根系吸水，抑制根系生长、细胞伸长及叶片正常发育
[4]；其次，植物体内积累的盐离子过多会对植物产生毒害作用，通过蒸腾流运输到地上部的盐离子使植物体内Na
+
和Cl
‑
浓度升高，过高的Na
+
和Cl
‑
造成植物叶片死亡
[5]。植物依据在盐渍环境下的生长发育特性可分为两大类别：盐生植物(耐土壤盐渍化)和甜土植物(不耐土壤盐渍化)，而大多数粮食作物属于甜土植物。盐生植物的存在增加了盐碱地的植被覆盖率，在减少漏光、增加光能利用、减少水分蒸发等方面发挥着重要的作用，同时，在固定土壤、提高土壤有机质含量、改善土壤的含砂量、松软程度及酸碱度等方面具有重要作用。
[0004]在盐胁迫下，盐生植物为了更好地生长，会在生理上发生一些变化以适应环境，这些变化受植物体内相关基因调控。盐胁迫诱导或抑制许多具有重要功能基因的表达，近年来，盐生耐盐基因及基因的表达调控已成为植物耐盐研究的热点
[6]。盐生植物盐生草(Halogeton glomeratus)是改良盐碱地的先锋植物，其自身具有很强的耐盐抗旱能力，含有大量耐盐基因，研究这些盐诱导表达基因及其编码蛋白的性质及功能，能够促进对蛋白结构和基因功能的认识，为提高植物耐盐抗旱能力奠定基础，也为耐盐植物新品种的选育提供依据。同时也对盐碱地修复，解决土壤盐渍化问题具有重要意义。
[0005]现有技术存在的问题：现有技术中未报道关于盐生草基因Hg50329调控盐生草耐盐性方面的功能和应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的关键技术问题在于提供盐生草基因Hg50329及其调控耐盐性方面的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]1.盐生草Hg50329基因，所述Hg50329基因转录本序列如序列表SEQ No.1所示，所述Hg50329基因发挥抗盐功能的片段如序列表SEQ No.2所示。
[0008]2.一种载体，所述载体包含如序列表SEQ No.1或SEQ No.2所示核苷酸片段。
[0009]3.供盐生草Hg50329基因克隆和载体构建方法，包括：(1)植株材料和试剂选择，
(2)RNA提取与反转录，(3)引物设计和基因克隆，(4)构建亚细胞定位载体、过表达载体及酵母表达载体。
[0010]4.盐生草Hg50329基因在农杆菌与酵母中的转化方法，包括：(1)转化农杆菌，(2)载体转化酵母缺陷型菌株。
[0011]5.盐生草Hg50329基因功能验证方法，包括：(1)亚细胞定位、拟南芥遗传转化和酵母缺陷型遗传转化；(2)转基因拟南芥获得及表型分析；(3)转缺陷型酵母表型分析及钠离子含量测定。
[0012]6.盐生草Hg50329基因在Na
+
外排与K
+
吸收方面的应用，所述盐生草Hg50329基因发挥功能的片段如序列表SEQ No.2所示。
[0013]7.盐生草Hg50329基因增强拟南芥抗盐性的应用，所述盐生草Hg50329基因发挥功能的片段如序列表SEQ No.2所示。
[0014]8.盐生草Hg50329基因在烟草细胞核上表达的应用，所述盐生草Hg50329基因发挥功能的片段如序列表SEQ No.2所示。
[0015]有益效果：本专利技术利用基因克隆的方式，成功克隆Hg50329基因。并构建亚细胞定位载体、过表达载体和酵母表达载体，在烟草中亚细胞定位发现Hg50329主要在细胞核上表达；成功转化拟南芥后，对T1代30天苗进行200mM NaCl盐胁迫，发现转基因苗较野生型拟南芥长势好，说明Hg.41242提升了其耐盐性；随培养基中Na
+
的增加，转化空载体pYES2的Na
+
敏感型酵母菌株AXT3体内Na
+
的含量升高，而转化Hg50329的Na
+
敏感型酵母菌株AXT3体内Na
+
的含量均降低，且显著低于转化空载体pYES2的酵母菌株体内Na
+
的含量，表明在酵母异源表达系统中，Hg50329参与Na
+
的外排。在含有100mM钾离子的培养基上，转化pYES2
‑
Hg50329较空载体pYES2的CY162酵母菌株长势好；在含有1mM、0.2mM钾离子以及不含钾离子的AP培养基上，转化空载体pYES2没有生长，而转化pYES2
‑
Hg50329的酵母菌株CY162却能够正常生长，且长势较好(图8C)；酵母菌株体内K
+
含量分析表明，随培养基中K
+
的升高，转化Hg50329和空载体pYES2的酵母菌株体内K
+
含量均显著升高，其中在低于7mM的培养基中，转化Hg50329的酵母菌株CY162体内K
+
含量显著高于转化空载体的菌株体内K
+
含量(图8D)，表明基因Hg50329具有恢复钾离子缺陷型酵母菌株CY162对K
+
的吸收能力，参与酵母中CY162对K
+
的吸收。
附图说明
[0016]图1为亚细胞定位载体pBI121
‑
eGFP结构图。
[0017]图中，Hg50329基因连接位置为XbaI与SmaI两个酶切位点之间。
[0018]图2为过表达载体pBI121
‑
GUS结构图。
[0019]图中，Hg50329基因连接位置为XbaI与SmaI两个酶切位点之间。
[0020]图3为酵母表达载体pYES2结构图。
[0021]图中，Hg50329基因连接位置为EcoR I与XbaI两个酶切位点之间。
[0022]图4为RNA琼脂糖凝胶电泳图。
[0023]图中，M：D15000Marker。
[0024]图5为PCR扩增目本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.盐生草Hg50329基因，其特征在于所述Hg50329基因转录本序列如序列表SEQ No.1所示，所述Hg50329基因发挥抗盐功能的片段如序列表SEQ No.2所示。2.一种载体，其特征在于所述载体包含如序列表SEQ No.1或SEQ No.2所示核苷酸片段。3.供盐生草Hg50329基因克隆和载体构建方法，其特征在于所述方法包括：(1)植株材料和试剂选择，(2)RNA提取与反转录，(3)引物设计和基因克隆，(4)构建亚细胞定位载体、过表达载体及酵母表达载体。4.盐生草Hg50329基因在农杆菌与酵母中的转化方法，其特征在于所述方法包括：(1)转化农杆菌，(2)载体转化酵母缺陷型菌株。5.盐生草Hg50329基因功能验证方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄志磊，王化俊，汪军成，姚立蓉，孙禄娟，李葆春，孟亚雄，马小乐，司二静，杨轲，陈倩，乔蕤，朱凯洋，庄沛鸿，李明治，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：