一种调控水稻垩白的基因OsB12D3及其编码蛋白和应用制造技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控水稻垩白的基因OsB12D3及其编码蛋白和应用；该基因及其编码蛋白参与稻米垩白调控，并影响稻米品质；采用常规方法对OsB12D3进行基因编辑和过量表达，从而改变该基因的表达水平，进而获得具有不同OsB12D3基因表达水平的水稻新种质；本发明专利技术创建的水稻与亲本对照相比，在植株的生长发育和基本农艺性状方面没有显著差异，但是显著地影响稻米的垩白粒率和垩白度；本发明专利技术中OsB12D3基因过量表达后能显著降低稻米的垩白粒率和垩白度，提高稻米的外观品质，为稻米品质的遗传改良提供了有用的基因资源，具有重要的育种利用价值。具有重要的育种利用价值。具有重要的育种利用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种调控水稻垩白的基因OsB12D3及其编码蛋白和应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种调控水稻垩白的基因OsB12D3及其编码蛋白和应用。

技术介绍

[0002]水稻是我国重要的粮食作物，我国60％以上人口以大米为主食。近年来我国水稻单产和总产量均呈增加趋势，然而优质稻米的培育进展相对较慢，这导致我国优质米的市场占有率较低。稻米的品质性状涉及多个方面，包括外观、食味和营养等，其中稻米外观品质直接决定稻米的商品价值，是稻米品质评价的关键指标之一。垩白是影响稻米外观品质的最重要因素，同时，其也对稻米的外观品质和食味品质有一定的影响。因此，稻米垩白水平的高低直接影响稻米的商业价值，如何快速改良垩白性状已成为目前我国水稻育种界亟需解决的难题。
[0003]在水稻籽粒的发育进程中，胚乳的灌浆是大量淀粉与蛋白质等储藏物物质积累的过程。期间淀粉或蛋白等物质的填充水平不仅影响水稻的产量还影响稻米的外观，尤其是储藏物填充不足时，容易造成淀粉粒间空腔的出现，并因此形成垩白表型。已有的研究表明，除遗传因素外，灌浆时期的温度、湿度、光照、水肥条件等许多因素都会显著影响垩白的产生。
[0004]有关稻米垩白的遗传调控已有很多研究，如参与稻米胚乳糖转运、能量代谢和抗逆响应等途径的一些基因都有可能影响到稻米垩白(Zhao et al.Genetic control of grain appearance quality in rice[J].Biotechnology advances,2022,60,108014.)。尽管如此，关于垩白的相关研究仍然存在大量空白，目前针对在育种中较为实用的垩白性状克隆的基因较少，如Chalk5是少有的较适用于垩白性状改良育种的基因(Li Yibo et al.Chalk5 encodes a vacuolar H(+)
‑
translocating pyrophosphatase influencing grain chalkiness in rice.[J].Nature genetics,2014,46(4):398
‑
404.)。因此，发现并克隆一些新的垩白调控基因，进一步发掘其育种应用潜力，对当前稻米品质育种研究具有重要理论和现实意义。

技术实现思路

[0005]为解决现有稻米外观品质改良过程中存在的问题，本专利技术提供一种调控水稻垩白的基因OsB12D3及其编码蛋白和应用，为稻米品质的遗传改良提供了新的基因资源。
[0006]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种调控水稻垩白的基因OsB12D3，所述水稻垩白基因OsB12D3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述水稻垩白基因OsB12D3的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示序列至少90％同源。
[0008]所述OsB12D3编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者所述OsB12D3编码的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所述序列至少90％同源。
[0009]第二方面，本专利技术提供一种调控水稻垩白的基因OsB12D3在降低水稻籽粒垩白、稻米品质改良中的应用。
[0010]所述的应用，所述应用的方法如下：对水稻垩白基因OsB12D3进行编辑、敲除、修饰、抑制或过量表达，使得目标水稻品种中的OsB12D3基因表达水平的改变，进而获得具有不同表现型的水稻植株。
[0011]优选的，所述基因编码过程中所用的载体为pC1300
‑
Cas9
‑
B12D3，包含基因OsB12D3；载体系统为CRISPR/Csa9；系统中包含中间载体SK
‑
gRNA和最终载体pC1300
‑
Cas9。
[0012]载体pC1300
‑
Cas9
‑
B12D3的制备方法，所述的方法如下：将引物与经过Aar I限制性内切酶切割后的线性中间载体SK
‑
gRNA混合，并用T4 DNA连接酶连接，得到质粒为SK
‑
gRNA
‑
B12D3，再利用限制性内切酶Kpn I和Bgl II切割SK
‑
gRNA
‑
B12D3质粒，回收300bp片段并与经过Kpn I和BamH I双酶切过的pC1300
‑
Cas9载体混合，利用并用T4 DNA连接酶连接。
[0013]优选的，所述引物序列如下：
[0014]序列名称序列序列编号Primer35'GGCAGCCGCGATGATGTTGGCAT 3'SEQ ID NO.5Primer45'AAACATGCCAACATCATCGCGGC 3'SEQ ID NO.6
[0015]优选的，所述基因过量表达过程中所用的过表达载体为3*Flag
‑
B12D3，包含基因OsB12D3，载体为植物表达载体pC1300Actin
‑
3*Flag，其中包括水稻自身组成性高表达基因Actin的启动子。
[0016]过量表达载体3*Flag
‑
B12D3的制备方法，所述的方法如下：将经限制性内切酶Sma I和Sal I切割线性化的携带有Actin启动子的pC1300Actin
‑
3*Flag载体与包含OsB12D3的PCR扩增产物进行混合，用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit进行同源重组连接。
[0017]优选的，所述PCR扩增引物序列如下：
[0018]序列名称序列序列编号Primer75'TCCCCCGGGATGGGGCGTTGGGTTAGGCCT 3'SEQ ID NO.9Primer85'GTCGACATCATCATTGTTCTCATCATGAT 3'SEQ ID NO.10
[0019]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术发现破坏OsB12D3基因编码蛋白的生物学功能能够显著影响稻米的外观品质，表现为籽粒垩白增加；而过量表达OsB12D3后，能够显著降低稻米垩白，使米质变好，说明该基因对改良稻米品质具有重要的作用。本专利技术为水稻外观品质的遗传改良提供了有用的基因资源和技术路线。
附图说明
[0020]图1为本专利技术实施例一中水稻中OsB12D3基因的表达模式分析；
[0021]图2为本专利技术实施例二中OsB12D3基因编辑靶位点和突变类型示意图；
[0022]图3为本专利技术实施例三中OsB12D3基因敲除株系稻米垩白分析；“**”表示极显著差异；
[0023]图4为本专利技术实施例四中OsB12D3基因过量表达株系目标基因表达量分析；“**”表示极显著差异；
[0024]图5为本专利技术实施例四中OsB12D3基因过量表达株系稻米垩白分析；“**”表示极显著差异。
具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控水稻垩白的基因OsB12D3，其特征在于，所述水稻垩白基因OsB12D3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述水稻垩白基因OsB12D3的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示序列至少90％同源。2.根据权利要求1所述的一种调控水稻垩白的基因OsB12D3，其特征在于，所述OsB12D3编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者所述OsB12D3编码的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所述序列至少90％同源。3.一种如权利要求1或2所述的调控水稻垩白的基因OsB12D3在降低水稻籽粒垩白、稻米品质改良中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法如下：对水稻垩白基因OsB12D3进行编辑、敲除、修饰、抑制或过量表达，使得目标水稻品种中的OsB12D3基因表达水平的改变，进而获得具有不同表现型的水稻植株。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因编码过程中所用的载体为pC1300
‑
Cas9
‑
B12D3，包含基因OsB12D3；载体系统为CRISPR/Csa9；系统中包含中间载体SK
‑
gRNA和最终载体pC1300
‑
Cas9。6.权利要求5所述载体pC1300
‑
Cas9
‑
B12D3的制备方法，其特征在于，所述的方法如下：将引物与经过Aar I限制性内切酶切割后的线性中间载体SK
‑
gRNA混合，并用T4 DNA连接酶连接，得到质粒为SK
‑
gRNA
‑
B12D3，再利用限制性内切酶Kpn I和Bgl II切割SK
‑
gRNA
‑
B12D...

【专利技术属性】
技术研发人员：张昌泉，牛广琰，刘巧泉，黄李春，李钱峰，陆彦，赵冬生，范晓磊，张林，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：