绞股蓝转录因子GpbHLH4及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种绞股蓝转录因子GpbHLH4，该转录因子GpbHLH4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明专利技术通过构建含有转录因子GpbHLH4的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染绞股蓝无菌叶片，获得转录因子GpbHLH4过表达阳性毛状根。利用实时荧光定量PCR方法检测转录因子GpbHLH4过表达阳性毛状根中绞股蓝皂苷合成路径关键酶基因的表达水平。利用高效液相色谱法检测转录因子GpbHLH4过表达阳性毛状根中绞股蓝皂苷含量。结果表明，转录因子GpbHLH4对绞股蓝皂苷的合成与积累具有正调控作用，可有效提高绞股蓝皂苷的含量。本发明专利技术为今后利用基因工程手段提高绞股蓝皂苷产量提供了一个新的策略。供了一个新的策略。供了一个新的策略。

【技术实现步骤摘要】
绞股蓝转录因子GpbHLH4及其应用


[0001]本专利技术属于植物生物
更具体地说，本专利技术涉及一种绞股蓝转录因子GpbHLH4及其应用。

技术介绍

[0002]绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino)是一味药食同源的中药材，为葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝的全草。现代研究表明：绞股蓝主要含有多种达玛烷型四环三萜皂苷成分，其中有一部分为人参皂苷Rb1、Rb3、Rd等，具有广泛的药理作用，可降血糖、降血脂，保护心脑血管降低心血管风险，并且在治疗和预防癌症及其他一些慢性疾病上也发挥了重要的作用。
[0003]毛状根遗传转化是一种基因工程和细胞工程相结合的新技术，它通过将发根农杆菌中Ri质粒含有的T
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DNA整合到植物细胞的DNA上，诱导植物细胞产生毛状根，具有遗传稳定性以及次生代谢产物的稳定性。目前，它已广泛应用于植物基因工程、植物次生代谢产物生产等领域，在研究植物次生代谢产物合成与调控方面具有独特的优势。
[0004]通过转录因子调控植物次生代谢途径中关键结构基因的表达，是实现中药有效成分高效合成和定向积累的有效途径。bHLH转录因子家族，是植物茉莉酸类激素响应途径中的核心转录因子，它主要通过与靶基因启动子上的G
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box(CACGTG)元件结合来调控基因的表达，在植物的生长发育、抵御逆境、信号转导及次生代谢调控等方面发挥关键的作用。目前尚未见到具有调控绞股蓝皂苷合成的bHLH转录因子的研究报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0006]本专利技术的一个目的是提供一种绞股蓝转录因子GpbHLH4，其能够调控绞股蓝皂苷合成。
[0007]为了实现本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种绞股蓝转录因子GpbHLH4，该转录因子GpbHLH4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
[0008]重组表达载体，所述重组载体包含如SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。
[0009]绞股蓝转录因子GpbHLH4编码的氨基酸序列，GpbHLH4编码的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
[0010]绞股蓝转录因子GpbHLH4在提高绞股蓝皂苷含量中的应用。
[0011]优选的是，绞股蓝皂苷至少包括绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd中的一种。
[0012]优选的是，绞股蓝转录因子GpbHLH4在提高绞股蓝皂苷含量中的应用，包括以下步骤：
[0013]a)构建绞股蓝转录因子GpbHLH4的过表达载体；
[0014]b)用步骤a)得到的过表达载体转化绞股蓝叶片，获得遗传转化的绞股蓝毛状根；
[0015]c)对步骤b)得到的绞股蓝毛状根进行筛选鉴定，筛选出过表达绞股蓝转录因子GpbHLH4的毛状根；
[0016]d)对过表达绞股蓝转录因子GpbHLH4的毛状根进行液体培养，即可提高绞股蓝皂苷含量。
[0017]本专利技术至少包括以下有益效果：
[0018]第一、本专利技术提供的转录因子GpbHLH4，其在绞股蓝毛状根中的过表达能够明显增加毛状根中绞股蓝皂苷含量。
[0019]第二、本专利技术对培育有效成分含量高的绞股蓝新种质具有重要的理论价值，对保障绞股蓝药材质量具有重要的产业意义。
[0020]本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0021]图1为PCR扩增转录因子GpbHLH4的电泳图；
[0022]图2为载体pK7WG2D的图谱；
[0023]图3为pK7WG2D
‑
GpbHLH4重组质粒菌落PCR电泳图；
[0024]图4为毛状根遗传转化过程图；其中，a为绞股蓝叶片作为外植体灭菌后预培养；b为诱导培养15天后长出2
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3cm毛状根；c为扩大培养30天的毛状根；
[0025]图5为毛状根根系rolB基因鉴定电泳图；其中，M为Markers；NC为阴性对照，1
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8分别代表经过筛选培养之后还存活的过表达GpbHLH4的根系；
[0026]图6为过表达GpbHLH4根系的鉴定电泳图。M为Markers；PC为阳性对照；NC为阴性对照；1
‑
8分别代表经过筛选培养之后还存活的过表达GpbHLH4的根系；
[0027]图7为基因表达分析示意图；其中，a为GpbHLH4的表达分析示意图；b为绞股蓝皂苷合成路径关键酶基因GpFPS1的表达分析示意图；c为绞股蓝皂苷合成路径关键酶基因GpSE2的表达分析示意图；d为绞股蓝皂苷合成路径关键酶基因GpOSC1的表达分析示意图；其中，EV为空载型毛状根；OE1、OE2、OE3分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3；**代表P＜0.01；
[0028]图8为过表达GpbHLH4对绞股蓝毛状根中几种绞股蓝皂苷含量；其中，a为绞股蓝皂苷A平均值(μg/g)；b为人参皂苷Rb1平均值(μg/g)；c为人参皂苷Rb3平均值(μg/g)；d为人参皂苷Rd平均值(μg/g)；其中，EV为空载型毛状根；OE1、OE2、OE3分别代表过表达株系OE1、OE2、OE3；**代表P＜0.01。
具体实施方式
[0029]下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0030]应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0031]需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0032]试验一、构建转录因子GpbHLH4的过表达载体
[0033]一、获取转录因子GpbHLH4基因片段
[0034]以绞股蓝基因组中转录因子GpbHLH4的CDS序列为参照设计特异引物SEQ.NO.3和SEQ.NO.4，交由上海生工公司合成。
[0035]引物的核苷酸序列如下所示：
[0036]SEQ.ID.NO.3：5
’‑
atggctgagttggtaatatccc
‑
3'。
[0037]SEQ.ID.NO.4：5'
‑
ctactctaatctagaaagaagagcgatt
‑
3'。
[0038]以绞股蓝叶片cDNA为模板，进行GpbHLH4基因片段扩增，目的片段扩增体系：2
×
Phanta Max Buffer，25μL；dNTP Mix(10mmol/L)，1μL；SEQ.ID.NO.3(10μmol/L)，2μL；SEQ.ID.NO.4(10μmol/L)，2μL；Phanta本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.绞股蓝转录因子GpbHLH4，其特征在于，该转录因子GpbHLH4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。2.重组表达载体，其特征在于，所述重组载体包含如SEQ.ID.1所示的核苷酸序列。3.绞股蓝转录因子GpbHLH4编码的氨基酸序列，其特征在于，转录因子GpbHLH4编码的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。4.绞股蓝转录因子GpbHLH4在提高绞股蓝皂苷含量中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，绞股...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄鼎，覃艳红，明如宏，谭勇，姚绍嫦，李良波，黄荣韶，
申请(专利权)人：广西中医药大学，
类型：发明
国别省市：