基于dCas9-VP64的转录激活系统构建的A549稳定表达细胞系及其应用技术方案

本发明专利技术公开了基于dCas9

【技术实现步骤摘要】
基于dCas9
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VP64的转录激活系统构建的A549稳定表达细胞系及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及基于dCas9
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VP64的转录激活系统构建的A549稳定表达细胞系及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR
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Cas是一种RNA介导的适应性免疫系统，存在于细菌和古细菌中，可保护宿主细胞免受外源DNA的入侵。根据Cas蛋白序列结构的不同，CRISPR
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Cas系统主要分为I、II和III三类。其中第I和第III两种类型的CRISPR
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Cas系统在切割外源DNA时需要多种Cas蛋白参与，过程较为复杂。而II型系统只需要一个蛋白即可完成剪切工作，相对较为简单、省时省力，在基因组工程中应用最为广泛。
[0003]对Cas蛋白HNH和RuvC两个结构域中的D10A和H840A氨基酸进行点突变可以获得剪切失活的Cas9蛋白。由此产生的核酸酶缺陷型dCas9不能切割DNA，但在sgRNA的引导下仍能与DNA特异性结合。基于此，研究人员融合了不同的转录调控相关的因子，以dCas9
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sgRNA复合物作为一个支架，将一系列转录效应因子募集到目标位置来激活或者抑制目标基因转录表达，从而发挥调控调节基因表达的重要作用。
[0004]利用dCas9融合蛋白招募转录激活剂介导的基因激活，称为CRISPRa(CRISPR activation)。在大肠杆菌中，dCas9与Pol的ω亚基融合，在特异性的sgRNA引导下，Pol被聚集到启动子的上游位置，在基因激活的靶启动子上组装全酶从而激活转录。真核细胞中，从基本的转录激活(VP64，p65)到增强的转录激活Sun Tag(dCas9
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VPR)系统再到协同激活介体系统(SAM系统)，CRISPRa技术已经经历了一系列升级。
[0005]VP64(单纯性疱疹病毒蛋白16的合成四聚体)或p65激活域(p65AD，核因子kappa B的激活域)与dCas9的融合可以激活报告基因和内源性基因。随着CRISPRa融合蛋白的陆续开发，研究者对CRISPR
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dCas9系统激活基因转录的结构优化为VP64、p65AD和Epstein
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Barr病毒R反式激活子Rta组成的三方激活子结构域VPR(VP64
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p65
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Rta)。使用多个sgRNAs靶向后，该系统能够更大程度地提高内源基因的激活效率并成功应用在酿酒酵母、果蝇和小家鼠细胞中。
[0006]除了对dCas9进行工程改造，对于sgRNA的工程化也可以提高基因激活的效率。在sgRNA中引入2个能与MS2噬菌体外壳蛋白(MCP)结合的MS2发夹环，以dCas9
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VP64作为支架，MS2招募其同源的MCP与p65AD和热休克因子1(HSF1)融合，称为协同激活介质(synergistic activation mediator，SAM)。与单独使用dCas9
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VP64相比，SAM技术显著提高了之前难以激活的12个基因的转录水平。
[0007]CRISPR
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dCas9调控基因表达的能力已被广泛应用于多个领域，包括干细胞分化、诱导细胞重编程、全基因组水平筛选、疾病机制研究、疾病模型构建、阐明基因功能研究、基因与基因的相互作用研究等方面。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达的物质的新用途。
[0009]本专利技术提供了激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达的物质在如下1)
‑
4)任一种中的应用：
[0010]1)制备预防和/或治疗肺癌的产品；
[0011]2)制备抑制肺癌细胞增殖的产品；
[0012]3)预防和/或治疗肺癌；
[0013]4)抑制肺癌细胞增殖；
[0014]所述LTR5Hs序列如序列1所示。
[0015]本专利技术的另一个目的是提供一种激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达的方法。
[0016]本专利技术提供的激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达的方法包括如下步骤：将激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达的物质导入肺癌细胞。
[0017]上述方法中，所述激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达的物质包括dCAS
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VP64融合蛋白、MS2
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P65
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HSF1融合蛋白和靶向LTR5Hs序列第83
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89位的sgRNA。其中，LTR5Hs序列第83
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89位为TP53结合位点。在本专利技术的一个具体实施例中，所述sgRNA的靶序列如序列10所示。
[0018]进一步的，上述方法可包括如下步骤：
[0019](1)将能够表达所述dCAS
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VP64融合蛋白的重组慢病毒A感染所述肺癌细胞，得到阳性细胞系；
[0020](2)向步骤(1)所得阳性细胞系中导入能够表达所述sgRNA和所述MS2
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P65
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HSF1融合蛋白的重组慢病毒B，进而实现激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达。
[0021]更进一步的，所述(1)中，所述阳性细胞系为经嘌呤霉素(Puromycin)筛选后得到dCas9蛋白相对表达量最高的细胞系。
[0022]所述(1)中，所述能够表达所述dCas9
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VP64融合蛋白的重组慢病毒A可为将含有所述dCas9
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VP64融合蛋白编码基因的慢病毒载体进行包装后得到的慢病毒。
[0023]所述(2)中，所述能够表达所述sgRNA和所述MS2
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P65
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HSF1融合蛋白的重组慢病毒B可为将含有所述sgRNA编码基因和所述MS2
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P65
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HSF1融合蛋白编码基因的慢病毒载体进行包装后得到的慢病毒。
[0024]在本专利技术的一个具体实施例中，含有所述dCas9
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VP64融合蛋白编码基因的慢病毒载体为lenti
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EF1a
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dCas9
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VP64
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Puro。
[0025]在本专利技术的一个具体实施例中，含有所述sgRNA编码基因和所述MS2
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P65
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HSF1融合蛋白编码基因的慢病毒载体为将sgRNA靶序列的编码基因插入慢病毒载体GV419(U6
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sgRNA
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SV40
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MS2
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P65
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HSF1
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T2A
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Neo)后得到的载体。
[0026]上述方法中，所述肺癌细胞具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达的物质在如下1)
‑
4)任一种中的应用：1)制备预防和/或治疗肺癌的产品；2)制备抑制肺癌细胞增殖的产品；3)预防和/或治疗肺癌；4)抑制肺癌细胞增殖；所述LTR5Hs序列如序列1所示。2.一种激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达的方法，包括如下步骤：将激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达的物质导入肺癌细胞。3.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的方法，其特征在于：所述激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达的物质包括dCas9
‑
VP64融合蛋白、MS2
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P65
‑
HSF1融合蛋白和靶向LTR5Hs序列第83
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89位的sgRNA。4.根据权利要求3所述的应用或方法，其特征在于：所述sgRNA的靶序列如序列10所示。5.根据权利要求2
‑
4任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)将能够表达所述dCas9
‑
VP64融合蛋白的重组慢病毒A感染所述肺癌细胞，得到阳性细胞系；(2)向步骤(1)所得阳性细胞系中导入能够表达所述sgRNA和所述MS2
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P65
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HSF1融合蛋白的重组慢病毒B，进而实现激活肺癌细胞中LTR5Hs序列表达。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述能够表达所述dCas9
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VP64融合蛋白的重组慢病毒A为将含有所述dCas9
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VP64融合蛋白编码基因的慢病毒载体进行包装后得到的慢病毒。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述能够表达所述sgRNA和所述MS2
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P65
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HSF1融合蛋白的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：李林，贾磊，刘梦莹，郭星，张伯寒，李韩平，刘永健，韩婧婉，王晓林，李敬云，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：