CAR-T靶向LMP1和EBNA-1治疗鼻咽癌的细胞系构建及动物实验方法技术

本发明专利技术提供了CAR

【技术实现步骤摘要】
CAR
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T靶向LMP1和EBNA
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1治疗鼻咽癌的细胞系构建及动物实验方法


[0001]本专利技术涉及热敏电阻材料制备
，特别涉及CAR
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T靶向LMP1和EBNA
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1治疗鼻咽癌的细胞系构建及动物实验方法。

技术介绍

[0002]随着科技的不断发展，热敏电阻器是一类对温度敏感、在不同的温度下表现出不同的电阻值的敏感元件，按照温度系数不同分为正温度系数热敏电阻器(PTC)和负温度系数热敏电阻器(NTC)。
[0003]其中负温度系数热敏电阻器(NTC)是一类电阻值随温度增大而减小的半导体材料，具有测温、控温、温度补偿、抑制浪涌等作用。常温NTC热敏电阻器中，主要采用过渡金属锰、镍、钴、铁、铜的氧化物制成的尖晶石结构NTC热敏电阻元件，它们得到了广泛的研究与应用。
[0004]在采用过渡金属锰、镍、钴、铁、铜的氧化物制成的尖晶石结构NTC热敏电阻材料中，因为这些过渡金属氧化物的挥发温度较低，这类NTC热敏电阻元件的制备烧结过程中容易产生原材料成分的挥发，使得产品的最终成分、产品的一致性和生产不同批次之间的重复性难于控制，为此，提出CAR
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T靶向LMP1和EBNA
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1治疗鼻咽癌的细胞系构建及动物实验方法。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术希望提供CAR
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T靶向LMP1和EBNA
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1治疗鼻咽癌的细胞系构建及动物实验方法，以解决或缓解现有技术中存在的技术问题，至少提供一种有益的选择。
[0006]本专利技术实施例的技术方案是这样实现的：
[0007]CAR
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T靶向LMP1和EBNA
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1治疗鼻咽癌的细胞系构建，包括以下步骤：
[0008]S1、构建CMV
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LMP1
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CAR
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EBNA
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1载体，琼脂糖凝胶电泳回收，连接产物转化，挑单克隆，摇菌，最后送测序，将构建好的质粒进行测序分析，经测序分析LMP1和EBN
‑
1成功插入载体中；
[0009]S2、慢病毒载体抽提和质检；
[0010]S3、慢病毒包装浓缩，对293T细胞进行冻存，对293T细胞进行传代，对293T细胞进行复苏；
[0011]S4、293T细胞系构建，准备目的细胞，提取293T细胞系蛋白进行Westernblot检测，CCK
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8法检测CAR
‑
T细胞对鼻咽癌细胞的作用；
[0012]S5、CAR
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T细胞构建，抽取病人外周血60ml，送至实验室进行CAR
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T细胞的生产，CAR
‑
T细胞活化，转染病毒，通过CCK
‑
8法检测对肿瘤细胞的增殖情况的影响，从而完成治疗鼻咽癌的细胞系构建。
[0013]进一步优选的：在所述S1中，琼脂糖凝胶电泳回收，包括以下步骤：
[0014]S11、在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好；
[0015]S12、将切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，加入3倍体积溶胶液DD(大约400μL)；
[0016]S13、在温度56℃的水浴放置10min直至胶完全溶解，且每2～3min颠倒混匀一次加速溶解；
[0017]S14、将上一步S13所得溶液加入吸附柱EC中，吸附柱放入收集管中，室温放置1min，转速12000rpm/min离心60sec，倒掉收集管中的废液；
[0018]S15、加入500μL漂洗液WB，转速12000rpm/min离心30sec，弃掉废液，重复一遍相同动作；
[0019]S16、将吸附柱EC放回收集管中，转速12000rpm/min离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应，室温放置5min；
[0020]S17、取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入在65～70℃水浴中加热后的30μL超纯水，室温放置2min，转速12000rpm/min离心时长1min；
[0021]S18、使用紫外分光光度计检测DNA的浓度，同时进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0022]进一步优选的：在所述S1中，连接产物转化，包括以下步骤：
[0023]S19、冰中解冻Stbl3感受态细胞，溶解后轻柔混匀菌液；
[0024]S110、加入10μL用于转化的DNA(10ng以下)至50μL感受态细胞中，混匀后冰中放置30min；
[0025]S111、42℃水浴90sec，迅速移入冰中放置2～3min；
[0026]S112、加入预先37℃保温的500μLLB培养基，37℃150rpm/min振荡培养45min。
[0027]S113、4000rpm/min离心时长1min，倒掉上清液，保留不少于100μL转化混合物涂筛选平板，37℃先正置培养30min，后倒置培养过夜。
[0028]进一步优选的：在所述S2中，慢病毒载体抽提和质检，包括以下步骤：
[0029]S21、柱平衡步骤：向吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，转速12000rpm/min(～13,400
×
g)离心时长1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0030]S22、取5
‑
15ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm/min(～13,400
×
g)离心时长1min，吸除上清液；向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1，先检查是否已加入RNaseA,使用移液器或/和涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀；
[0031]S23、向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解；
[0032]S24、向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，转速12000rpm/min(～13,400
×
g)离心时长10min，此时在离心管底部形成沉淀；
[0033]S25、将上一步S24收集的上清液分次加入吸附柱CP4中，吸附柱放入收集管中，其容量为750
‑
800μL，注意尽量不要吸出沉淀，转速12000rpm/min(～13,400
×
g)离心时长1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；
[0034]S26、向吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，转速12000rpm/min(～13,400
×
g)离心时长1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4重新放回收集管中。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CAR
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T靶向LMP1和EBNA
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1治疗鼻咽癌的细胞系构建，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建CMV
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LMP1
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CAR
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EBNA
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1载体，琼脂糖凝胶电泳回收，连接产物转化，挑单克隆，摇菌，最后送测序，将构建好的质粒进行测序分析，经测序分析LMP1和EBN
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1成功插入载体中；S2、慢病毒载体抽提和质检；S3、慢病毒包装浓缩，对293T细胞进行冻存，对293T细胞进行传代，对293T细胞进行复苏；S4、293T细胞系构建，准备目的细胞，提取293T细胞系蛋白进行Westernblot检测，CCK
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8法检测CAR
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T细胞对鼻咽癌细胞的作用；S5、CAR
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T细胞构建，抽取病人外周血60ml，送至实验室进行CAR
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T细胞的生产，CAR
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T细胞活化，转染病毒，通过CCK
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8法检测对肿瘤细胞的增殖情况的影响，从而完成治疗鼻咽癌的细胞系构建。2.根据权利要求1所述的CAR
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T靶向LMP1和EBNA
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1治疗鼻咽癌的细胞系构建，其特征在于：在所述S1中，琼脂糖凝胶电泳回收，包括以下步骤：S11、在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下；S12、将切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，加入3倍体积溶胶液DD；S13、在温度56℃的水浴放置10min直至胶完全溶解，且每2～3min颠倒混匀一次加速溶解；S14、将上一步S13所得溶液加入吸附柱EC中，吸附柱放入收集管中，室温放置1min，转速12000rpm/min离心60sec，倒掉收集管中的废液；S15、加入500μL漂洗液WB，转速12000rpm/min离心30sec，弃掉废液，重复一遍相同动作；S16、将吸附柱EC放回收集管中，转速12000rpm/min离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应，室温放置5min；S17、取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入在65～70℃水浴中加热后的30μL超纯水，室温放置2min，转速12000rpm/min离心时长1min；S18、使用紫外分光光度计检测DNA的浓度，同时进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。3.根据权利要求1所述的CAR
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T靶向LMP1和EBNA
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1治疗鼻咽癌的细胞系构建，其特征在于：在所述S1中，连接产物转化，包括以下步骤：S19、冰中解冻Stbl3感受态细胞，溶解后轻柔混匀菌液；S110、加入10μL用于转化的DNA至50μL感受态细胞中，混匀后冰中放置30min；S111、42℃水浴90sec，迅速移入冰中放置2～3min；S112、加入预先37℃保温的500μLLB培养基，37℃150rpm/min振荡培养45min。S113、4000rpm/min离心时长1min，倒掉上清液，保留不少于100μL转化混合物涂筛选平板，37℃先正置培养30min，后倒置培养过夜。4.根据权利要求1所述的CAR
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T靶向LMP1和EBNA
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1治疗鼻咽癌的细胞系构建，其特征在于：在所述S2中，慢病毒载体抽提和质检，包括以下步骤：S21、柱平衡步骤：向吸附柱CP4中加入500μL的平衡液BL，转速12000rpm/min，离心时长1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
S22、取5
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15ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm/min，离心时长1min，吸除上清液；向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1，先检查是否已加入RNaseA,使用移液器或/和涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀；S23、向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解；S24、向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，转速12000rpm/min，离心时长10min，此时在离心管底部形成沉淀；S25、将上一步S24收集的上清液分次加入吸附柱CP4中，吸附柱放入收集管中，其容量为750
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800μL，注意尽量不要吸出沉淀，转速12000rpm/min，离心时长1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；S26、向吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，转速12000rpm/min，离心时长1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4重新放回收集管中。S27、向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李心红，赵鹏伟，李军，徐海霞，裴秀峰，徐凌，
申请(专利权)人：内蒙古医科大学，
类型：发明
国别省市：