一种美登素新型衍生物及其生物合成方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种美登素新型衍生物及其生物合成方法与应用。本发明专利技术发现了来源于拟诺卡氏菌EGI80425和宏基因组的SAM依赖型甲基转移酶基因pba295、pba296、pba304和nan291，其与氨甲酰基转移酶asc21b共表达可实现美登素新型衍生物3

【技术实现步骤摘要】
一种美登素新型衍生物及其生物合成方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种美登素新型衍生物及其生物合成方法与应用，属于微生物制药


技术介绍

[0002]安丝菌素(ansamitocins)是一类由微生物产生的美登素类化合物，具有极高的细胞毒性。安丝菌素通过与微管蛋白的β亚基结合，阻碍微管蛋白的聚合，抑制肿瘤细胞的有丝分裂导致细胞死亡。安丝菌素目前主要由珍贵束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum)ATCC 31565或ATCC 31280及其衍生菌株通过工业发酵生产，其发酵主产物安丝菌素P
‑
3(AP
‑
3)先还原脱去C
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3位酯基获得关键中间体美登醇，再用于美登素类抗体偶联药物(如T
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DM1)的合成。然而，目前AP
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3的发酵产量不高，同时存在P
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2、P
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4、PND、AGP和ACGP等同系物杂质，导致分离纯化工艺复杂，成本居高不下。
[0003]安丝菌素Pr/>‑
3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种美登素新型衍生物3
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O
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氨甲酰美登醇，其特征在于，其化学结构如下所示：2.一种用于生产权利要求1所述3
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O
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氨甲酰美登醇的工程菌，其特征在于，所述工程菌的代谢产物中含有上式所示的3
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O
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氨甲酰美登醇。3.如权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌同时表达负责C
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3位修饰的3
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O
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氨甲酰基转移酶和负责酰胺N
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甲基化修饰的甲基转移酶；所述3
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O
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氨甲酰基转移酶的编码基因为asc21b，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述甲基转移酶的编码基因为pba295、pba296、pba304或nan291，核苷酸序列依次如SEQ ID NO.2～5所示，氨基酸序列依次如SEQ ID NO.7～10所示。4.权利要求2所述的用于生物合成3
‑
O
‑
氨甲酰美登醇的工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：(1)以白色拟无枝酸菌(Amycolatopsis alba)DSM 44262的基因组DNA为模板进行高保真PCR扩增，得到两端分别引入NdeI和NheI酶切位点的asc21b基因片段，PCR产物经NdeI和NheI双酶切后，与载体pUC
‑
kasOp*
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T
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NdeI/NheI连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经验证和提取获得质粒pUC
‑
asc21b；(2)以拟诺卡氏菌(Nocardiopsisansamitocini)EGI80425基因组DNA为模板进行高保真PCR扩增，获得两端分别引入NdeI和NheI酶切位点nan291基因片段，PCR产物经NdeI和NheI双酶切，得到nan291
‑
NdeI/NheI片段；人工合成两端引入NdeI和SpeI酶切位点的SAM依赖型甲基转移酶pba295，pba296和pba304基因，克隆于pUC57载体中，经NdeI和SpeI双酶切获得pba295
‑
NdeI/SpeI、pba296
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NdeI/SpeI和pba304
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NdeI/SpeI片段；将nan291
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NdeI/NheI、pba295
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NdeI/SpeI、pba296
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NdeI/SpeI和pba304
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NdeI/SpeI片段分别与载体片段pUC
‑
kasOp*
‑
T
‑
NdeI/NheI连接，连接产物分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经验证和提取获得质粒pUC
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pba295、pUC
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pba296、pUC
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pba304和pUC
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nan291；(3)质粒pUC
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asc21b经MfeI和SpeI双酶切后获得asc21b
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MfeI/SpeI片段；质粒pUC
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pba295、pUC
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pba296、pUC
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pba304和pUC
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nan291经XbaI和PstI双酶切后获得pba295
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XbaI/PstI、pba296
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XbaI/PstI、pba304
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XbaI/PstI和nan291
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XbaI/PstI片段；将asc21b
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MfeI/SpeI和载体片段p15ACIS
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EcoRI/PstI分别与pba295
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XbaI/PstI、pba296
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【专利技术属性】
技术研发人员：王浩鑫，刘清清，李瑶瑶，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：