用于测定来自样品的NAD代谢物的量的方法以及与其相关的方法和用途技术

本发明专利技术涉及生命科学领域和医学领域。具体地，本发明专利技术涉及一种用于制备来自受试者的样品的包括如NAD+、NADP+、NADH和NADPH等代谢物的提取物的方法，并且涉及一种用于测定来自从受试者获得的样品的NAD+、NADP+、NADH、NADPH、NAD+/NADH比率、NADPH/NADP+比率、NAD池和/或NADP池的量的方法。本发明专利技术还涉及包括如NAD+、NADP+、NADH和NADPH等代谢物的提取物。同样地，本发明专利技术涉及一种试剂盒，其包括提取溶液、包括电子载体、色原体和非离子型去污剂的检测系统以用于测定来自受试者的样品的NAD+、NADP+、NADH、NADPH、NAD+/NADH比率、NADPH/NADP+比率、NAD池和/或NADP池，以及任选地GSH、GSSG和/或GSH/GSSG比率的量。此外，本发明专利技术涉及一种本发明专利技术的试剂盒用于测定受试者的样品中NAD+、NADP+、NADH、NADPH、NAD+/NADH比率、NADPH/NADP+比率、NAD池、NADP池、GSH、GSSG和/或GSH/GSSG比率的量或其变化的用途，例如用于诊断目的或用于监测人的健康状况变化。此外，本发明专利技术涉及一种用于测定受试者的病症的方法和试剂盒。于测定受试者的病症的方法和试剂盒。于测定受试者的病症的方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测定来自样品的NAD代谢物的量的方法以及与其相关的方法和用途


[0001]本专利技术涉及生命科学领域和医学领域。具体地，本专利技术涉及一种用于制备来自受试者的样品的包括如NAD+、NADP+、NADH和NADPH等代谢物的提取物的方法，并且涉及一种用于测定来自从受试者获得的样品的NAD+、NADP+、NADH、NADPH、NAD+/NADH比率、NADPH/NADP+比率、NAD池(NAD+和NADH一起)和/或NADP池(NADP+和NADPH一起)的方法。本专利技术还涉及包括如NAD+、NADP+、NADH和NADPH等代谢物的提取物。同样地，本专利技术涉及一种试剂盒，其包括提取溶液、包括电子载体、色原体和非离子型去污剂的检测系统以用于测定来自受试者的样品的NAD+、NADP+、NADH、NADPH、NAD+/NADH比率、NADPH/NADP+比率、NAD池(NAD+和NADH一起)和/或NADP池(NADP+和NADPH一起)，以及任选地GSH、GSSG和/或GSH/GSSG比率。此外，本专利技术涉及本专利技术的试剂盒用于测定受试者的样品中NAD+、NADP+、NADH、NADPH、NAD+/NADH比率、NADPH/NADP+比率、NAD池(NAD+和NADH一起)、NADP池(NADP+和NADPH一起)、GSH、GSSG和/或GSH/GSSG比率或其变化的用途，例如用于诊断目的或用于监测人的健康状况变化。此外，本专利技术涉及一种用于测定受试者的病症的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]维生素B3在维持所有组织的体内平衡中发挥关键作用。维生素B3的缺乏和过量两者都对健康有害，并且维生素B3与许多严重的疾病相关(Williams AC和Hill LJ,2020《国际色氨酸研究杂志(Int J Tryptophan Res)》)。人需要维生素B3来产生四种也被称为吡啶核苷酸的NAD代谢物。NAD代谢物由氧化型NAD+和NADP+；以及还原型NADH和NADPH组成。其成对发挥作用，并且NAD+、NADP+、NADH、NADPH的单独浓度以及其比率(NAD+/NADH和NADPH/NADP+)调节许多重要的代谢过程，如基因表达、细胞能量代谢、还原性生物合成、抗氧化应激防御和钙信号传导。因此，单独浓度和比率的分析对于得出B3/NAD体内平衡的结论至关重要。维生素B3的充足性可以通过测量NAD池(NAD+加NADH代谢物)和NADP池(NADP+加NADPH代谢物)来评估。此外，NADP+和NADPH的水平和其比率NADPH/NADP+直接调节细胞中还原型谷胱甘肽的水平。谷胱甘肽在保护细胞免受氧化损伤并维持氧化还原体内平衡和其代谢方面发挥着关键作用，其代谢已被充分研究。还原型谷胱甘肽是抗氧化剂，其一旦被氧化，就可以使用NADPH代谢物再循环回到其还原型。因此，对来自生物样品的NAD和谷胱甘肽形式的分析为细胞还原
‑
氧化(氧化还原)状态提供了极好的视角。由于所述形式需要具体的提取方法和分析平台，因此无法从单个生物样品中获得分析所有这些形式的测定。
[0003]生物样品中NAD+和NADP+的浓度可以使用LC
‑
MS测量，而其NAD+加NADP+池可以使用HPLC测量。LC
‑
MS和HPLC价格昂贵，需要特殊的专业知识，并且不是每个实验室都能轻易获得的。与氧化的NAD形式相比，还原的NAD形式更难分离和分析，因为其对稳定性有特殊要求。
[0004]例如，US 6,287,796 B1描述了用于测量生物样品中NAD代谢物的细胞内浓度的比色法和试剂盒。专利描述了一种用于测量NAD(NAD+和NADH一起)和NADP(NADP+和NADPH一
起)总池的方法，以计算所谓的烟酸值((NAD/NADP)*100)，从而示出维生素B3补充的充分性。所述方法不允许对NAD代谢物的还原型(NADH或NADPH)和氧化型(NAD+或NADP+)进行单独分析。
[0005]目前还没有方便的方法用于定量测量来自一个生物样品的所有四个核苷酸NAD+、NADH、NADP+和NADPH。此外，现有技术方法被认为是不可靠的，因为例如非线性应答、长温育时间、需要对不同代谢物进行单独的提取，或者结果通常仅以比率给出，而不是以浓度描述的绝对量给出，这阻碍了分析集或不同研究实验室之间结果的比较。
[0006]此外，现有技术方法中没有一种方法描述了全血样品中NAD代谢物的单独浓度，例如所有四种NAD代谢物的单独浓度的测量。由于血红蛋白的高浓度，血液对于所述分析特别困难。
[0007]事实上，对于从单一样品中单独测定所有四种NAD代谢物的浓度或NAD平衡的简单、有效且具体的方法和工具，仍然存在显著的、长期感觉到的、迫切的和未满足的需求。此类方法的开发将在个性化医学领域和制药行业中取得重大进展，因为其将允许对将从治疗中受益的个体进行靶向治疗，如用NAD增强剂进行治疗，这是一个在全世界呈指数增长的领域。

技术实现思路

[0008]本专利技术克服了现有技术中用于测量包含全血样品的生物样品中NAD代谢物浓度的方法的问题，所述问题包含但不限于1)还原型和氧化型NAD代谢物在不同pH下的不稳定性；2)细胞中的大多数NAD代谢物是蛋白质结合的；以及3)还原型NAD代谢物的稳定性，即还原型NAD代谢物形式在生理pH下易于降解。
[0009]本专利技术的一个方面基于用于从取自受试者的生物样品中制备包括所有四种NAD代谢物的提取物的方法。所述方法能够从样品有效提取NAD代谢物，并允许在提取物中保持所述代谢物而不降解。
[0010]本专利技术的另一个方面使得能够从样品中分离所有四种NAD代谢物，以及测量这些代谢物中任一种的量或其任何组合的量。本专利技术的易于使用的方法可以用于例如从血液样品单独测量所有四种NAD代谢物的水平。所述方法允许从非常少量的样品中提取和分析，如从单滴血中提取和分析。本专利技术的目的，即用于提取代谢物(例如，细胞内代谢物)的方法和用于测定来自从受试者获得的样品的NAD+、NADP+、NADH、NADPH；NAD+/NADH比率、NADPH/NADP+比率、NAD池(NAD+和NADH一起)和/或NADP池(NADP+和NADPH一起)的量的方法，以及与其相关的工具，通过利用方法步骤的具体组合或试剂的具体组合来实现。
[0011]事实上，当与现有技术相比时，本专利技术的优势在于能够保存和测量所有四种NAD代谢物NAD+、NADH、NADP+和NADPH的单独的浓度，以测定1)维生素B3的充足性；和/或2)NAD+/NADH和NADPH/NADP+的比率，作为体内代谢变化或病理变化或医疗干预需要的敏感指标。此外，本专利技术允许使用NAD代谢物中的任何一种或多种NAD代谢物的单独浓度或NAD代谢物中的任何NAD代谢物的池作为代谢变化或病理变化的敏感指标。重要的是，NAD代谢物中的任何NAD代谢物的测量的单独浓度可以用作正常和/或病理代谢变化的独立生物标志物，并且其可以被整合到具体病状的生物标志物的集中。代谢本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于测定来自从受试者获得的样品的NAD+、NADP+、NADH、NADPH、NAD+/NADH比率、NADPH/NADP+比率、NAD池和/或NADP池的量的方法，其中所述方法包括步骤A；B或C；以及D：A)通过使样品与预热到至少40℃的非缓冲醇溶液接触，获得包括样品的NAD代谢物NAD+、NADP+、NADH和NADPH的提取物，以及B)i)在所述提取物的第一部分中通过酸处理稳定NAD+和NADP+并消除NADH和NADPH，和/或在所述提取物的第二部分中通过在加热下进行碱处理稳定NADH和NADPH并消除NAD+和NADP+，用于测定NAD+、NADP+、NADH和NADPH的量；并且执行以下Bii)
‑
v)中的一个或多个，ii)在包括电子载体、色原体和非离子型去污剂的检测系统存在的情况下，使所述提取物的所述第一部分的NAD+与第一NAD特异性酶接触，以获得用于测定NAD+的量的酶反应，iii)在包括电子载体、色原体和非离子型去污剂的检测系统存在的情况下，使所述提取物的所述第二部分的NADH与第一NAD特异性酶接触，以获得用于测定NADH的量的酶反应，iv)在包括电子载体、色原体和非离子型去污剂的检测系统存在的情况下，使所述提取物的所述第一部分的NADP+与第二NADP特异性酶接触，以获得用于测定NADP+的量的酶反应，和/或v)在包括电子载体、色原体和非离子型去污剂的检测系统存在的情况下，使所述提取物的所述第二部分的NADPH与第二NADP特异性酶接触，以获得用于测定NADPH的量的酶反应；和/或C)i)在包括电子载体、色原体和非离子型去污剂的检测系统存在的情况下，使所述提取物的第三部分的NAD+和NADH一起与第一NAD特异性酶接触，以获得用于测定NAD池的量的酶反应，和/或ii)在包括电子载体、色原体和非离子型去污剂的检测系统存在的情况下，使所述提取物的第四部分的NADP+和NADPH一起与第二NADP特异性酶接触，以获得用于测定NADP池的量的酶反应；以及D)i)通过将检测系统对添加的提取物的应答与具有已知浓度的标准物的应答进行比较来测定所述样品中NAD+、NADP+、NADH和/或NADPH的量，以发现所述提取物中NAD代谢物的浓度，随后对所述样品的蛋白质含量、组织质量或体积进行归一化和/或计算NAD+/NADH比率、NADPH/NADP+比率和/或NAD池(NAD+和NADH一起)和/或NADP池(NADP+和NADPH一起)，或ii)通过将检测系统对添加的提取物的应答与具有已知浓度的标准物的应答进行比较来测定所述样品中NAD池和/或NADP池的量，以发现所述提取物中NAD代谢物的浓度，随后对所述样品的蛋白质含量或体积进行归一化。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括关于总蛋白量或样品重量或全血体积对测定的NAD+、NADH、NADP+和/或NADPH水平进行归一化，和/或计算NAD+/NADH和/或NADPH/NADP+比率。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一NAD特异性酶选自由以下组成的组：醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、NAD特异性异柠檬酸脱氢酶、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶和其任何组合；和/或所述第二NADP特异性酶选自由以下组成的组：葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶、6
‑
磷酸葡萄糖酸脱氢酶、苹果酸酶、NADP特异性异柠檬酸脱氢酶和其任何组合。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述电子载体是吩嗪硫酸乙酯(PES)
和/或所述色原体是3
‑
(4,5
‑
二甲基噻唑
‑2‑
基)
‑
2,5
‑
二苯基四唑溴化物(MTT)，用于测定NAD+、NADP+、NADH、NADPH。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非离子型去污剂用于防止3
‑
(4,5
‑
二甲基噻唑
‑2‑
基)
‑
2,5
‑
二苯基四唑溴化物(MTT)在酶反应过程中在还原时聚集。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非离子型去污剂包括聚环氧乙烷单元和/或选自包括吐温
‑
20、TritonX
‑
100和壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP
‑
40)的组。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括测定GSH、GSSG的量和/或GSH/GSSG比率；或者所述方法包括同时测量来自同一样品的NAD+/NADH、NADPH/NADP+和GSH/GSSG比率或NADPH/NADP+和GSH/GSSG比率，用于测定或测量细胞或身体的氧化还原状态。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法包括：i)通过化学修饰从A)的所述提取物的第五部分去除GSH，并在添加的NADPH和用于测定GSSG的报道基因存在的情况下，使所述提取物的所述第五部分的GSSG与GSH特异性酶，如谷胱甘肽还原酶接触，和/或ii)在添加的NADPH和用于测定GSH和GSSG的报道基因存在的情况下，使A)的所述提取物的第六部分的GSH和GSSG与GSH特异性酶，如谷胱甘肽还原酶接触。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述报道基因是命名为Ellman试剂的5,5'
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中通过添加掩蔽试剂1
‑
甲基
‑4‑
乙烯基
‑
吡啶鎓三氟甲烷磺酸盐(M4VP)和/或1
‑
甲基
‑2‑
乙烯基
‑
吡啶鎓三氟甲烷磺酸盐(M2VP)实现从所述提取物的所述第五部分去除GSH。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过允许任选地选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和其组合的去污剂与所述酶反应接触停止所述酶反应。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将包括所述提取物的第一部分和/或第二部分、电子载体、色原体和非离子型去污剂的第一试剂组合以及所述第一NAD特异性酶用于酶反应以用于测定NAD+和/或NADH的量。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将包括所述提取物的第一部分和/或第二部分、电子载体、色原体和非离子型去污剂的第二试剂组合以及所述第二NADP特异性酶用于酶反应以用于测定NADP+和/或NADPH的量。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将包括所述提取物的第五部分和/或第六部分、添加的NADPH和报道基因的第三试剂组合以及GSH特异性酶，如谷胱甘肽还原酶用于酶反应以用于测定GSH和/或GSSG的量。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中单独测定NAD+和NADH，单独测定NADP+和NADPH，同时测定GSH和GSSG，和/或单独测定GSSG。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过比色法测量NAD+、NADH、NADP+、NADPH、NAD池、NADP池、GSH和/或GSSG或其任何组合。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在一个或多个酶反应之后，通过测量在560nm至580nm或570nm至573nm的波长下的吸光度测定NAD+、NADP+、NADH、NADPH、NAD池
和/或NADP池。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在酶反应之后，通过测量在400nm至420nm或410nm至415nm的波长下的吸光度测定GSH和/或GSSG。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括从所述样品中提取NAD代谢物以及还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，以获得包括NAD+、NADP+、NADH、NADPH、GSH和GSSG的所述提取物。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括从所述样品制备包括NAD+、NADP+、NADH和NADPH的所述提取物，从而允许所述样品与醇溶液在高温下接触以获得所述样品和所述醇溶液的混合物，冷却获得的混合物，并从所述混合物中去除沉淀的多肽以获得包括NAD+、NADP+、NADH和NADPH的提取物。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述醇溶液包括乙醇、甲醇和/或异丙醇；或者所述醇溶液是乙醇溶液、甲醇溶液或异丙醇溶液。22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述醇溶液的醇浓度为约30％至80％、40％至70％、40％至60％、40％至50％、50％至70％、50％至60％、50％或60％。23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述高温为约40℃至90℃、40℃至60℃、45℃至80℃、50℃至80℃、60℃至80℃、70℃至80℃、60℃或75℃。24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中在高温下的接触时间选自由约10秒至10分钟、约30秒至5分钟和约1分钟组成的组。25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中用于冷却所述获得的混合物的时段为约30秒至30分钟、1分钟至10分钟、5分钟至10分钟或3分钟至7分钟。26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中通过离心去除所述沉淀的多肽。27.根据权利要求20至26中任一项所述的方法，其中所述混合物是匀浆。28.一种试剂盒，其包括提取溶液、标准物的储备溶液、停止溶液、检测系统，所述检测系统包括电子载体、色原体、非离子型去污剂和用于测定来自受试者的样品的NAD+、NADP+、NADH、NADPH、NAD+/NADH比率、NADPH/NADP+比率、NAD池和/或NADP池的NAD特异性酶和NADP特异性酶，并且任选地包括色原体和用于测定来自受试者的所述样品的GSH、GSSG和/或GSH/GSSG比率的GSH特异性酶。29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中用于测定NAD+、NADP+、NADH、NADPH、NAD+/NADH比率、NADPH/NADP+比率、NAD池、NADP池的所述NAD特异性酶和NADP特异性酶选自由以下组成的组：醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、NAD特异性异柠檬酸脱氢酶、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶和其任何组合；和/或选自由以下组成的组：葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶、6
‑
磷酸葡萄糖酸脱氢酶、苹果酸酶、NADP特异性异柠檬酸脱氢酶和其任何组合；和/或用于测定GSH、GSSG和/或GSH/GSSG比率的所述GSH特异性酶是谷胱甘肽还原酶。30.根据权利要求28或29所述的试剂盒，其中所述检测系统包括电子载体吩嗪硫酸乙酯(PES)和/或色原体3
‑
(4,5
‑
二甲基噻唑
‑2‑
基)
‑
2,5
‑
二苯基四唑溴化物(MTT)。31.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于防止3
‑
(4,5
‑
二甲基噻唑
‑2‑
基)
‑
2,5
‑
二苯基四唑溴化物(MTT)在酶反应过程中在还原时聚集的非离子型去污剂。32.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述非离子型去污剂包括聚环氧
乙烷单元和/或选自包括吐温
‑
20、TritonX
‑
100和壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP
‑
40)的组。33.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：赫尔辛基大学，
类型：发明
国别省市：