C末端的CDNF和MANF片段、包含它们的药物组合物及其用途制造技术

本发明专利技术提供了C末端CDNF片段序列或与所述序列具有至少80％同源性或序列同一性的序列。所述C末端CDNF片段保护ER应激神经元、运动神经元和多巴胺能神经元，并且所述片段能够穿透神经元细胞膜以及血脑屏障。本发明专利技术还提供了所述片段和包含所述片段的药物组合物，用于治疗退行性疾病和病症，包括中枢神经系统疾病、糖尿病和视网膜病症。本发明专利技术还提供了C末端MANF片段序列或与所述序列具有至少80％同源性或序列同一性的序列，以及包含所述MANF片段的药物组合物，用于治疗退行性疾病和病症，包括中枢神经系统疾病、糖尿病和视网膜病症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】C末端的CDNF和MANF片段、包含它们的药物组合物及其用途
本专利技术涉及生物活性蛋白片段和细胞膜穿透肽的领域，还涉及神经营养因子和定位(located)内质网(ER)蛋白的领域，更具体地涉及治疗退行性疾病或病症例如中枢神经系统疾病、糖尿病和视网膜病症的领域。
技术介绍
神经营养因子脑多巴胺神经营养因子(CDNF)和中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)(Lindholm和Saarma，2010；Lindahl等，2017)是目前用于治疗大鼠的6-OHDA的帕金森氏病(PD)模型中最有效的蛋白。当在毒素前施用时，这两种因子均有效地预防了由6-OHDA诱导的帕金森氏病的行为和组织学症状(Lindholm等，2007；Voutilainen等，2009)。更重要的是，当在6-OHDA诱导的帕金森氏病症状已经影响深远的阶段应用时，用这两种因子进行的后处理(即6-OHDA诱导后的治疗)都能有效地恢复正常的运动行为和纹状体的多巴胺能神经支配(innervation)。(Lindholm等，2007；Voutilainen等，2011)。在帕金森氏病的小鼠和恒河猴MPTP模型中，CDNF还能保护和修复多巴胺神经元。在猴MPTP模型以及严重的啮齿动物6-OHDA模型中，它在恢复黑质致密部(SNPc)中的多巴胺神经元和恢复运动行为方面比胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)更有效(Voutilainen等，2011；Airavaara等，2012：Voutilainen等，2015)。对这些因子的神经元保护作用背后的机制尚不完全清楚，但是已经表明，除了激活经典的促生存抗凋亡途径外，它们还调节未折叠蛋白反应(UPR)途径，旨在减轻氧化应激和ER应激并抑制ER应激诱导的凋亡细胞死亡(Lindahl等，2014；Lindahl等，2017；Voutilainen等，2017)。许多病理生理状况和退行性疾病，包括糖尿病和诸如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病(AD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和亨廷顿氏病(HD)的神经退行性疾病，都与触发了ER应激以及UPR途径激活的蛋白质错误折叠和聚集有关。因此，CDNF和MANF的作用已经在各种中枢神经系统疾病中显示出来(WO2009133247；WO2007068803；和Airavaara等，2009)。此外，CDNF和MANF抑制神经炎症，神经炎症参与了大多数(如果不是全部)CNS疾病和损伤的病理生理(Nadella等，2014；Neves等，2016；Zhao等，2013)。此外，WO2014191630公开了一种遗传修饰的非人类动物，其包含一种基因(天然地编码并表达功能性MANF基因)的断裂等位基因(disruptedallele)，其中所述动物由于该断裂的和非功能性MANF而显示出进行性的出生后胰腺β细胞量减少。还建议了递送有效量的MANF或CDNF多肽或其功能片段用于1型或2型糖尿病的胰腺内治疗的基因治疗载体(genetherapyvector)。此外，Lindahl等人(2014年)披露，MANF蛋白对于胰腺β细胞的增殖和存活是必不可少的，从而构成了用于β细胞保护和再生的治疗候选物。WO2013034805公开了长度为4个至40个氨基酸的可穿透细胞的MANF或CDNF肽，其包含序列CXXC，用于治疗阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症、中风、周围神经病变、癫痫、糖尿病或药物成瘾性。CDNF和MANF的结构研究表明，这些蛋白由两个结构域(domain)组成：saposin样N末端结构域(Parkash等，2009)和SAP样C末端(Hellman等，2011)。CXXC基序(人MANF的残基149-152，NCBI参考序列：NP_006001.3)位于C末端结构域(C-MANF)中在该结构域螺旋核心之外的环(loop)区，并且半胱氨酸与二硫键连接(Hellman等，2011)。CDNF的相应基序位于相同位置(NCBI参考序列：NP_001025125.2)。已表明，在交感神经元内部表达时，C-MANF具有很强的体外抗凋亡作用(Hellman等，2011)。等人(2013年)披露了MANF和CDNF的结构与功能决定因素的表征。具有选择渗透性的细胞膜以与细胞内膜在内部区室中的行为相似的方式来控制在细胞质与细胞外环境之间的分子交换。由于这个原因，细胞质膜通常对许多分子，特别是高分子量分子例如全长蛋白的细胞内递送构成挑战性障碍。高分子量分子通过这种屏障的主动转运通常需要能够穿过脂质双层的特定载体。细胞穿透肽(CPP)通常是5–30个氨基酸长的肽(或肽内的基序)，它们由于其穿过细胞膜的能力而被广泛用于在细胞内递送蛋白质、质粒DNA、RNA、寡核苷酸、脂质体和抗癌药物(Borrelli等，2018；Bode&2017；Kalafatovic&Giralt，2017；Kristensen等，2016)。
技术实现思路
在本专利技术中，已发现CDNF蛋白的C-末端片段在体外和体内出人意料地保护了ER应激的交感神经和多巴胺能神经元，与全长CDNF相反，该片段在体内能够穿透神经元细胞膜以及血脑屏障。因此，本专利技术的目的是提供一种C末端CDNF片段，其至少包括在SEQIDNO:1MPAMKICEKLKKLDSQICELKYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL所示的序列中的位置38-70或25-57处的连续氨基酸残基或者与SEQIDNO:1中的位置38-70或25-57处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，或者至少由这二者中之一组成。本专利技术还提供了一种药物组合物，其包含C末端CDNF片段和以下至少一种：生理上可接受的载体(carrier)、缓冲剂、赋形剂、防腐剂和稳定剂。本专利技术的结果还提供了所述C末端CDNF片段，其用于治疗包括中枢神经系统(CNS)疾病、糖尿病或视网膜疾病在内的退行性疾病或病症，其中所述CNS疾病优选选自阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷顿氏病和其他淀粉样病，多系统萎缩症，肌萎缩侧索硬化症，额颞叶变性(frontotemporallobardegeneration)，路易体痴呆，轻度认知障碍，创伤性脑损伤，周围神经损伤，成瘾和中风。本专利技术还表明，与成熟的MANF蛋白相反，MANF的C-末端片段(C-MANF)能够穿透多巴胺神经元的细胞膜并保护培养物中的神经元。因此，本专利技术的另一个目的是提供一种C末端MANF片段，其优选具有36-78个氨基酸的长度，其至少包括在SEQIDNO:2：ICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL所示的序列中的位置33-68或19-52处的连续氨基酸残基或者与SEQIDNO:2中的位置33-68或19-52处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，或者至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种C末端CDNF片段，其至少包括在SEQ ID NO:1：/nMPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTDYVNLIQELAP KYAATHPKTE L/n所示的序列中的位置38-70或25-57处的连续氨基酸残基或者与SEQ ID NO:1中的位置38-70或25-57处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，或者至少由这二者中之一组成，/n其中，所述片段是细胞膜穿透肽并且对神经元细胞具有保护作用，并用作药物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180329 FI 201853041.一种C末端CDNF片段，其至少包括在SEQIDNO:1：
MPAMKICEKLKKLDSQICELKYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL
所示的序列中的位置38-70或25-57处的连续氨基酸残基或者与SEQIDNO:1中的位置38-70或25-57处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，或者至少由这二者中之一组成，
其中，所述片段是细胞膜穿透肽并且对神经元细胞具有保护作用，并用作药物。


2.根据权利要求1所述的片段，其用于治疗退行性疾病或病症。


3.根据权利要求2所述的片段，其中，所述退行性疾病是神经退行性疾病。


4.根据权利要求3所述的片段，其中，所述神经退行性疾病是选自以下的中枢神经系统(CNS)疾病：阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，多系统萎缩症，肌萎缩侧索硬化症，额颞叶变性，路易体痴呆，轻度认知障碍，亨廷顿氏病，创伤性脑损伤，药物成瘾性和中风。


5.根据权利要求4所述的片段，其中，所述CNS疾病是帕金森氏病。


6.根据权利要求2所述的片段，其用于治疗I型或II型糖尿病。


7.根据权利要求3所述的片段，其用于治疗肌萎缩侧索硬化症。


8.根据权利要求2所述的片段，其用于治疗视网膜病症，例如色素性视网膜炎。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的片段，其中，所述片段通过静脉内给药、腹膜内、皮下、鞘内、脑室内、鼻内、透皮、脑内、肌内、眼内或动脉内给药来施用，或所述片段通过病毒表达载体来施用。


10.根据权利要求9所述的片段，其中，所述静脉内给药是外周给药。


11.根据前述权利要求中任一项所述的片段，其优选具有长达33-81个氨基酸的长度，其中，所述片段至少包括在SEQIDNO:1所示的序列中的位置38-70或25-57处的连续氨基酸残基或者与SEQIDNO:1中的位置38-70或25-57处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，并且，如果存在，则在所述连续氨基酸残基侧翼的序列优选与SEQIDNO:1中相应位置处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性。


12.根据权利要求11所述的片段，其中，所述片段至少包括在SEQIDNO:1所示的序列中的位置37-70、36-70、35-70、34-70、33-70、32-70或31-70处的连续氨基酸残基或者与SEQIDNO:1中的位置37-70、36-70、35-70、34-70、33-70、32-70或31-70处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，或者至少由这二者中之一组成，并且，如果存在，则在所述连续氨基酸残基侧翼的序列优选与SEQIDNO:1中相应位置处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性。


13.根据权利要求11所述的片段，其中，所述片段至少包括在SEQIDNO:1所示的序列中的位置25-57、25-58、25-59、25-60、25-61、25-62、25-63、25-64、25-65、25-66、25-67、25-68、25-69或25-70处的连续氨基酸残基或者与SEQIDNO:1中的位置25-57、25-58、25-59、25-60、25-61、25-62、25-63、25-64、25-65、25-66、25-67、25-68、25-69或25-70处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，或者至少由这二者中之一组成，并且，如果存在，则在所述连续氨基酸残基侧翼的序列优选与SEQIDNO:1中相应位置处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性。


14.根据权利要求12或13所述的片段，其中，所述片段至少包括在SEQIDNO:1所示的序列中的位置31-73(肽6；SEQIDNO:15)、位置25-73(肽4；SEQIDNO:13)、位置21-73(肽3；SEQIDNO:12)、位置21-70(肽7；SEQIDNO:16)、位置31-81(肽5；SEQIDNO:14)、位置25-81(肽2；SEQIDNO:11)、位置25-57(肽15，SEQIDNO:24)或位置37-73(肽8，SEQIDNO:17)处的连续氨基酸残基或者与SEQIDNO:1中的位置31-73、25-73、21-73、21-70、31-81、25-81、25-57或37-73处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，或者至少由这二者中之一组成，并且，如果存在，则在所述连续氨基酸残基侧翼的序列优选与SEQIDNO:1中相应位置处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性。


15.根据权利要求14所述的片段，其中所述片段至少包括在SEQIDNO:1所示的序列中的位置31-73或25-57处的连续氨基酸残基或者与SEQIDNO:1中的位置31-73或25-57处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，或者至少由这二者中之一组成，并且，如果存在，则在所述连续氨基酸残基侧翼的序列优选与SEQIDNO:1中相应位置处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性。


16.根据前述权利要求中任一项所述的片段，其具有长达43-81个氨基酸、优选43-61个氨基酸的长度。


17.根据前述权利要求中任一项所述的片段，其中，所述片段的末端包括进一步的修饰以保护所述片段免于酶促降解。


18.根据前述权利要求中任一项所述的片段，其中，所述C末端CDNF片段由SEQIDNO:1：
MPAMKICEKLKKLDSQICELKYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL
所示的序列或者与SEQIDNO:1的序列具有至少90％的同源性或序列同一性的序列中的至少50个连续氨基酸残基组成。


19.根据权利要求18所述的片段，其中，与序列SEQIDNO:1具有至少90％的同源性或序列同一性的所述序列包括在SEQIDNO:1中的位置52-55处的序列CXXC，其中X是任意氨基酸。


20.根据权利要求19所述的片段，其中，与序列SEQIDNO:1具有至少90％的同源性或序列同一性的所述序列由以下序列SEQIDNO:3的至少50个连续氨基酸残基组成：
MPAMKICEKLKKLDSQICELKYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECXXCAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL
其中，X是任意氨基酸。


21.根据权利要求19所述的片段，其中，与序列SEQIDNO:1具有至少90％的同源性或序列同一性的所述序列包括SEQIDNO:1的位置52-55中的序列CKGC。


22.根据权利要求17至21中任一项所述的片段，其中，所述片段包括SEQIDNO:1的位置81中的C末端氨基酸L。


23.根据权利要求17、18或20中任一项所述的片段，其中，所述片段缺少与SEQIDNO:1的位置78-81相对应的ER滞留信号KTEL。


24.根据前述权利要求17至23中任一项所述的片段，其中，所述片段包括C末端的酰胺化和N末端的乙酰化作为进一步的修饰。


25.根据前述权利要求中任一项所述的片段，其还与可检测的化学或生物化学的部分缀合。


26.根据前述权利要求中任一项所述的片段，其中，所述片段是细胞穿透肽，并且能够穿透人血脑屏障。


27.根据前述权利要求中任一项所述的片段，其中所述片段对蛋白酶切割具有抗性。


28.根据权利要求27所述的片段，其中，所述片段包括延伸、缺失、插入、替代或修饰，使得所述延伸、缺失、插入、替代或修饰消除了至少一个蛋白酶切割位点。


29.根据权利要求27或28所述的片段，其中，所述蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。


30.根据权利要求27至29中任一项所述的片段，其中，所述半胱氨酸蛋白酶是组织蛋白酶K。


31.根据权利要求27至29中任一项所述的片段，其中，所述金属蛋白酶为MMP-9。


32.根据权利要求27至29中任一项所述的片段，其中，所述金属蛋白酶是MMP-3。


33.根据权利要求27至29中任一项所述的片段，其中，所述丝氨酸蛋白酶是糜蛋白酶A或弹性蛋白酶-2。


34.根据权利要求27至33中任一项所述的片段，其中，与SEQIDNO:1中的残基1-8、16-23、26-33、32-39、37-44、38-45、43-50、46-53、57-64、59-66、60-67或68-75相对应的区域内的任意一个氨基酸是被替换的、缺失的或经修饰的。


35.根据权利要求27至34中任一项所述的片段，其中，与SEQIDNO:1中的46、49、35、63、4、71、19、40、41、62或29相对应的位置处的任意氨基酸是被替换的或经修饰的。


36.一种药物组合物，其包含如权利要求1和11至35中任一项所定义的C末端CDNF片段以及以下至少一种：生理上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、防腐剂和稳定剂。


37.根据权利要求36所述的药物组合物，其用于静脉内给药、腹膜内、皮下、鞘内、脑室内、鼻内、透皮、脑内、肌内、眼内或动脉内给药，所述静脉内给药优选外周给药，或者所述组合物经由病毒表达载体给药。


38.根据权利要求36或37所述的药物组合物，其用作药物。


39.根据权利要求38所述的药物组合物，其用于治疗退行性疾病或病症。


40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中，所述退行性疾病或病症是选自以下的中枢神经系统(CNS)疾病：阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，多系统萎缩症，肌萎缩侧索硬化症，额颞叶变性，路易体痴呆，轻度认知障碍，亨廷顿氏病，创伤性脑损伤，药物成瘾性和中风。


41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中，所述CNS疾病是帕金森氏病。


42.根据权利要求40的所述的药物组合物，其中，所述CNS疾病是肌萎缩侧索硬化症。


43.根据权利要求40所述的药物组合物，其用于治疗I型或II型糖尿病。


44.根据权利要求40所述的药物组合物，其用于治疗视网膜病症，例如色素性视网膜炎。


45.一种C末端CDNF片段，其至少包括在SEQIDNO:1：
MPAMKICEKLKKLDSQICELKYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL
所示的序列中的位置38-70或25-57处的连续氨基酸残基或者与SEQIDNO:1中的位置38-70或25-57处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，或者至少由这二者中之一组成，其中，所述片段是细胞膜穿透肽并对神经元细胞有保护作用。


46.根据权利要求45所述的片段，其具有长达57、53、51、50、49、43、37或33个氨基酸的长度，其中，所述片段至少包括在SEQIDNO:1所示的序列中的位置31-70或25-57处的连续氨基酸残基或者与SEQIDNO:1中的位置31-70或25-57处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，并且，在所述连续氨基酸残基侧翼的序列与SEQIDNO:1中相应位置处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性。


47.根据权利要求46所述的片段，其中，所述片段至少包括在SEQIDNO:1所示的序列中的位置37-70、36-70、35-70、34-70、33-70、32-70或31-70处的连续氨基酸残基或者与SEQIDNO:1中的位置37-70、36-70、35-70、34-70、33-70、32-70或31-70处的序列具有至少80％的同源性或序列同一性的序列，或者至少由这二者中之一组成。


48.根据权利要求46所述的片段，其中，所述片段至少包括在SEQIDNO:1所示的序列中的位置25-57、25-58、2...

【专利技术属性】
技术研发人员：玛特·萨尔玛，米科·艾拉瓦拉，梅尔贾·沃蒂莱宁，俞利英，玛丽亚·琳达尔，
申请(专利权)人：赫尔辛基大学，
类型：发明
国别省市：芬兰;FI