作用于靶蛋白的多肽的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种对作用于靶蛋白的多肽进行筛选的方法。具体而言，涉及一种对作用于靶蛋白的多肽进行筛选的方法，所述方法包括：(1)提供由可在革兰氏阴性菌中表达的多个表达载体构成的多核苷酸库的工序，其中，所述多个表达载体分别包含编码互不相同的多肽的第一多核苷酸、配置在所述第一多核苷酸上游的分泌信号序列、以及编码靶蛋白的第二多核苷酸；(2)用所述表达载体转化革兰氏阴性菌，使所述多肽在周质空间间隙内、所述靶蛋白在内膜表面分别表达的工序；(3)使所述多肽与所述靶蛋白在周质空间间隙内接触的工序；(4)使革兰氏阴性菌形成原生质球，并通过电生理学方法测定所述多肽对所述靶蛋白的活性的工序；以及(5)基于测定的活性，鉴定作用于所述靶蛋白的所述多肽的工序。序。序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作用于靶蛋白的多肽的筛选方法


[0001]相关申请本申请要求基于日本专利申请2020
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132823号(2020年8月5日申请)的优先权，其内容作为参照并入本说明书。
本专利技术涉及对作用于靶蛋白的多肽进行筛选的方法、用于所述方法的库、以及所述库的新制作方法。

技术介绍

[0002]毒蜘蛛等的毒液中所含的ICK肽是具有三个二硫键的多肽。ICK肽不被消化酶分解，通过向大鼠的静脉内给药，可以数小时都在血液中检出(非专利文献1)。
[0003]已知ICK肽作用于离子通道并发挥其毒性。专利技术人克隆了作用于离子通道的ICK肽并分析了其特性(非专利文献2和3)。将ICK肽库化后，可以构建聚焦离子通道的肽库，作用于各种离子通道的肽的创制成为可能。
[0004]已知离子通道与各种疾病有关(非专利文献2)，但由于离子通道开闭的刺激主要是膜电位的变化、温度变化、机械刺激等，因此，无法采取合成展开化合物库中的命中化合物的方法，推进离子通道制药通常伴随困难。
[0005]作为利用大肠杆菌的内膜和周质空间、搜索作用于离子通道和受体的肽的技术，专利技术人设计出了PERISS(intra Periplasm Secretion and Selection)法，并进行着研究开发(专利文献1)。在该方法中，通过在大肠杆菌的周质空间中使离子通道聚焦肽库表达、在周质空间中与在内膜中表达的靶分子相互作用来搜索候选肽。
[0006]为了用PERISS法推进离子通道制药，有必要确认在大肠杆菌内膜中的离子通道在具有活性的状态下表达。免疫印迹等以往技术可以确认离子通道的表达，但无法评价其是否以正确的立体结构、在具有活性的状态下表达。因此，专利技术人等成功地开发了用膜片钳技术电生理学测定在大肠杆菌内膜中强制表达的离子通道的活性的技术(非专利文献4)。
[0007]作为在大肠杆菌周质空间中展示分子的方法，已知有Anchored periplasmic expression法(专利文献2、非专利文献5)。该技术包括：(1)使靶分子在大肠杆菌周质空间中表达；(2)在大肠杆菌外膜上开微小孔；(3)在培养液中添加荧光标签的配体库；以及(4)以该荧光为指标用细胞分选仪回收与靶分子结合的配体，鉴定经过这样的工序与靶分子结合的配体。利用大肠杆菌周质空间作为反应场这一点与PERISS法是共通的，但在其他点上是不同的技术。现有技术文献专利文献
[0008]专利文献1：日本特开2014－207905专利文献2：WO 2005/019409(日本特表2006
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515514)非专利文献
[0009]非专利文献1：Kikuchi等人,“High Proteolytic Resistance of Spider
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Derived Inhibitor Cystine Knots”International Journal of Peptides(2015)Vol.2015,Article ID 537508非专利文献2：Kimura等人,“Molecular Cloning and Sequence Analysis of the cDNAs Encoding Toxin
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Like Peptides from the Venom Glands of Tarantula Grammostola rosea”International Journal of Peptides”(2012)Vol.2012,Article ID 731293非专利文献3：Ono等人,“Characterization of voltage
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dependent calcium channel blocking peptides from the venom of the tarantula Grammostola rosea”(2011)Toxicon 58 265
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276.非专利文献4：Kikuchi等人,“The application of the Escherichia coli giant spheroplast for drug screening with automated planar patch clamp system”(2015)Biotechnology Reports 7,p17
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23非专利文献5：Harvey等人,“Anchored periplasmic expression,a versatile technology for the isolation of high
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affinity antibodies from Escherichia coli
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expressed libraries”(2004)Proc Natl Acad Sci Vol.101,No.25,p9193
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9198.

技术实现思路

专利技术要解决的课题
[0010]在以往的PERISS法中，用磁珠选择与靶分子结合的肽，用新一代测序仪等分析库部分。得到的肽具有什么样的活性，在DNA测序后，必须生产编码的肽，并评价其活性。然而，对于像ICK肽这样分子内具有多个二硫键的肽，其化学合成需要时间和成本，并且通过大肠杆菌进行重组生产也伴随着困难。
[0011]本专利技术的课题是提供一种简便地评价PERISS法得到的候选肽的活性、更有效地搜索目标肽的方法和用于此方法的工具。用于解决课题的手段
[0012]为了解决上述课题，专利技术人等进行了深入研究发现，在PERISS法中，通过膜片钳技术电生理学测定在大肠杆菌内膜中表达的靶蛋白与在周质空间间隙内表达的肽的相互作用，可以确定该肽对靶蛋白的作用。
[0013]还发现通过将ODA法应用于已知的膜蛋白的配体的立体结构，预测与其他蛋白相互作用可能性高的位点，并通过将该位点的序列随机化，可以制作用于搜索作用于(或相互作用)各种靶蛋白的多肽的库。
[0014]本专利技术基于上述认知，提供以下[1]至[15]。[1]一种对作用于靶蛋白的多肽进行筛选的方法，所述方法包括：(1)提供由可在革兰氏阴性菌中表达的多个表达载体构成的多核苷酸库的工序，其中，所述多个表达载体分别包含编码互不相同的多肽的第一多核苷酸、配置在所述第一多核苷酸上游的分泌信号序列、以及编码靶蛋白的第二多核苷酸；(2)用所述表达载体转化革兰氏阴性菌，使所述多肽在周质空间间隙内、所述靶蛋白在内膜表面分别表达的工序；
(3)使所述多肽与所述靶蛋白在周质空间间隙内接触的工序；(4)使革兰氏阴性菌形成原生质球，并通过电生理学方法测定所述多肽对所述靶蛋白的活性的工序；以及(5)基于测定的活性，鉴定作用于所述靶蛋白的所述多肽的工序。[2]根据[1]所述的方法，其中，所述革兰氏阴性菌是大肠杆菌。[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述靶蛋白是膜蛋白。[4]根据[3]所述的方法，其中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对作用于靶蛋白的多肽进行筛选的方法，所述方法包括：(1)提供由可在革兰氏阴性菌中表达的多个表达载体构成的多核苷酸库的工序，其中，所述多个表达载体分别包含编码互不相同的多肽的第一多核苷酸、配置在所述第一多核苷酸上游的分泌信号序列、以及编码靶蛋白的第二多核苷酸；(2)用所述表达载体转化革兰氏阴性菌，使所述多肽在周质空间间隙内、所述靶蛋白在内膜表面分别表达的工序；(3)在周质空间间隙内使所述多肽与所述靶蛋白接触的工序；(4)使革兰氏阴性菌形成原生质球，并通过电生理学方法测定所述多肽对所述靶蛋白的活性的工序；以及(5)基于测定的活性，鉴定作用于所述靶蛋白的所述多肽的工序。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述革兰氏阴性菌是大肠杆菌。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述靶蛋白是膜蛋白。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述膜蛋白是膜受体、离子通道或转运体。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述电生理学方法是膜片钳技术。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法包括：所述多核苷酸库对编码预先与靶蛋白结合的多肽的第一多核苷酸进行富集的工序。7.一种作用于靶蛋白的多肽的制造方法，所述制造方法包括：通过权利要求1至6中任一项所述的方法，鉴定作用于靶蛋白的多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：木村忠史，
申请(专利权)人：国立研究开发法人产业技术总合研究所，
类型：发明
国别省市：