肺腺癌诊断、转移和免疫治疗疗效检测标志物以及试剂盒制造技术

本发明专利技术属于医疗卫生技术领域，具体为一种肺腺癌诊断、转移及免疫治疗疗效检测标志物以及试剂盒。本发明专利技术提供的肺腺癌诊断、转移及免疫治疗疗效检测标志物为血清外泌体蛋白，所述外泌体蛋白为外泌体膜上的纤维蛋白样蛋白1。所述试剂盒包括：提取血清外泌体用试剂，对外泌体内FGL1通过流式细胞术进行检测的试剂，对外泌体内FGL1进行酶联免疫吸附测定用试剂等。试剂盒通过对待测样本血清外泌体的FGL1蛋白进行定量检测,并通过与阈值进行比较,便可判定待测样本存在肺腺癌的风险并对癌症转移及免疫治疗疗效进行检测判断。本试剂盒的标志物提取简单，制备方便快捷，检测结果准确、可靠。可靠。可靠。

【技术实现步骤摘要】
肺腺癌诊断、转移和免疫治疗疗效检测标志物以及试剂盒


[0001]本专利技术属于医疗卫生
，具体涉及一种肺腺癌诊断、转移及免疫治疗疗效检测标志物以及试剂盒。

技术介绍

[0002]肺腺癌(lung adenocarcinoma)是肺癌的一种，属于非小细胞癌。不同于鳞状细胞肺癌，肺腺癌较容易发生于女性及抽烟者。肺腺癌一般起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺。发病率比鳞癌和未分化癌低，发病年龄较小，女性相对多见。多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌。早期一般没有明显的临床症状，生长较慢，但有时早期即发生血行转移。现在迫切的需要一种较为灵敏的诊断标记物，为发生远处转移的肺腺癌的早期诊断、早期治疗及预后判断提供客观依据。
[0003]近年来，免疫检查点抑制剂(ICIs)已应用于临床，并在PD
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1/PD
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L1和CTLA
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4/B7通路方面取得了巨大进展。然而临床实践中发现其疗效只体现在一小群肿瘤患者中，对具体患者的治疗反应性预测仍是重要研究问题。目前的免疫治疗反应性生物标记物包括PD
‑
L1、CD8、CXCL9、TMB等并不能提供稳定的预测效能。这表明，在具有高度复杂性的肿瘤微环境中，存在着其他免疫因素影响治疗反应性，对这些因素的研究是临床上开发肿瘤个体化精准免疫治疗的重要基础。目前，在临床研究中只有20％的患者受益于免疫检查点阻断治疗，而其余患者则不同程度地表现出原发性或适应性耐药性，对这类患者，需要一种简单易行的指标进行早期疗效预测。
[0004]外泌体是细胞分泌的细胞外囊泡，含有原细胞的多种生物分子，如蛋白质、mRNA、microRNA和脂质，参与细胞间通讯。肿瘤来源的外泌体(Tumor
‑
derived exosomes，TDEs)已经被证明可以促进肿瘤的侵袭和转移。TDEs中含有蛋白质、脂类和核酸等成分。它可以参与细胞间的信息交换，从而调节肿瘤的生成、血管生成、侵袭和转移。外泌体内容物如miRNAs，蛋白质等在外泌体膜的保护下免受酶的降解，TDEs易于在血液样本中获得。因此可以在循环血液中被稳定检测到，使其成为了一种理想的生物标志物。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种用于肺腺癌早期诊断，并对其是否有转移，以及抗PD
‑
L1免疫治疗疗效进行判断的标志物及试剂盒。
[0006]本专利技术首先提供一种用于肺腺癌诊断、转移和免疫治疗疗效的检测标志物，具体为血清外泌体蛋白。
[0007]所述的血清外泌体蛋白为外泌体膜上的纤维蛋白原蛋白1即FGL1，又称肝细胞源性纤维蛋白原相关蛋白1即HFREP1。
[0008]该标志物可用于早期诊断肺腺癌，并可对其是否有转移，以及抗PD
‑
L1免疫治疗是否有效进行判断。
[0009]据此，本专利技术还提供用于肺腺癌诊断、转移和免疫治疗疗效检测试剂盒；具体地，
包括：
[0010](1)肺腺癌筛查试剂盒，该试剂盒中包括如下检测试剂：包括1X PBS磷酸盐缓冲溶液等提取血清外泌体用试剂和1ug生物素标记的抗CD63抗体、10μl链霉亲和素磁珠、抗FGL1抗体、Alexa Fluor 647驴抗兔IgG二抗等对外泌体内FGL1通过流式细胞术进行检测的试剂；
[0011](2)肺腺癌远处转移检测试剂盒，该试剂盒中包括如下检测试剂：包括1X PBS磷酸盐缓冲溶液等提取血清外泌体用试剂和蛋白裂解缓冲液、预包被FGL1抗体的ELISA板、100μl生物素抗体、100μl TMB显色液、50μl终止液等对外泌体内FGL1进行酶联免疫吸附测定用试剂；
[0012](3)PD
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L1免疫疗效检测试剂盒，该试剂盒中包括如下检测试剂：包括1X PBS磷酸盐缓冲溶液等提取血清外泌体用试剂和1ug生物素标记的抗CD63抗体、10μl链霉亲和素磁珠、抗FGL1抗体、Alexa Fluor 647驴抗兔IgG二抗等对外泌体内FGL1通过流式细胞术进行检测的试剂。
[0013]进一步地：
[0014]本专利技术提供的肺腺癌早期诊断试剂盒，利用流式细胞术检测样品中标志物的含量进行判断，若样本中标志物大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的样本存在较大的肺腺癌风险。
[0015]本专利技术提供的肺腺癌远处转移检测试剂盒，利用酶联免疫吸附剂检测样品中标志物的含量进行判断；若样本中标志物大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的样本存在较大肺腺癌远处转移的风险。
[0016]本专利技术提供的肺腺癌抗PD
‑
L1免疫治疗疗效检测试剂盒，利用流式细胞术检测样品中标志物的含量进行判断，若样本中标志物小于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的样本存在较大的疾病缓解(PR)可能。
[0017]本专利技术中，所述样品为血液样品，按照以下方法提取其中的外泌体：全血样品在4℃环境中，以2000g离心10分钟后取上层血清用1X PBS磷酸盐缓冲溶液重悬，将重悬液2000g离心10分钟，再10000g离心30min，随后取上清，0.22μm过滤，再以100000g离心70min，弃上清，沉淀以PBS重悬后，再以100000g离心70min，弃上清，沉淀以PBS重悬，即得外泌体。
[0018]本专利技术中，所示利用流式细胞术检测样品中标志物的含量，具体为：10μg外泌体首先与1ug生物素标记的抗CD63抗体(353018，Biolegend)在室温下共孵育2小时使其结合。接下来，加入10μl链霉亲和素磁珠，并在室温下孵育2小时。用PBS洗涤样品3次。然后将磁珠/抗CD63抗体/外泌体复合物与抗FGL1抗体(ab275091，Abcam)在室温下共孵育1小时，并用PBS洗涤3次。加入Alexa Fluor 647驴抗兔IgG二抗(ab150075，Abcam)，在室温下孵育1h。最后，将复合物洗涤3次并重悬于300μlPBS中，通过流式细胞术进行抗原检测。
[0019]本专利技术中，所述利用酶联免疫吸附剂检测样品中标志物的含量，具体为：20μg外泌体用裂解缓冲液在室温下处理30min后定容至100μl稀释缓冲液中，并加入预包被的ELISA板(96孔)(ELH
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HFREP1
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1，Raybiotech)。室温下孵育2.5小时后每孔加入100μl生物素抗体，室温下孵育1小时后，每孔加入100μl链霉亲和素溶液，室温下孵育45分钟后每孔加入100μl TMB显色液，室温下孵育半小时后每孔加入50μl终止液，在30分钟内测定450nm处的吸光度值。
[0020]进一步地，
[0021]本专利技术提供的肺腺癌早期诊断试剂盒，利用流式细胞术检测样品中标志物的含量进行判断，判断的临界值为FGL1阳性细胞量的比值为13.65％。当样本检测FGL1阳性细胞群比例＜13.65％时，代表该样本存在肺腺癌的可能性较小；当检测FGL1阳性细胞群比例≥本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肺腺癌诊断、转移和免疫治疗疗效的检测标志物，其特征在于，具体为血清外泌体蛋白，所述血清外泌体蛋白为外泌体膜上的纤维蛋白原蛋白1即FGL1；该标志物用于早期诊断肺腺癌，并可对其是否有转移，以及抗PD
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L1免疫治疗是否有效进行判断。2.一种用于肺腺癌诊断、转移和免疫治疗疗效检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)肺腺癌筛查试剂盒，该试剂盒中包括如下检测试剂：1X PBS磷酸盐缓冲溶液，1ug生物素标记的抗CD63抗体，10μl链霉亲和素磁珠，抗FGL1抗体，Alexa Fluor 647驴抗兔IgG二抗；(2)肺腺癌远处转移检测试剂盒，该试剂盒中包括如下检测试剂：1X PBS磷酸盐缓冲溶液，蛋白裂解缓冲液，预包被FGL1抗体的ELISA板，100μl生物素抗体，100μl TMB显色液，50μl终止液；(3)PD
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L1免疫疗效检测试剂盒，该试剂盒中包括如下检测试剂：1X PBS磷酸盐缓冲溶液，1ug生物素标记的抗CD63抗体，10μl链霉亲和素磁珠，抗FGL1抗体，Alexa Fluor 647驴抗兔IgG二抗。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述肺腺癌早期诊断试剂盒，利用流式细胞术检测样品中标志物的含量进行判断，若样本中标志物大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的样本存在较大的肺腺癌风险；所述肺腺癌远处转移检测试剂盒，利用酶联免疫吸附剂检测样品中标志物的含量进行判断；若样本中标志物大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的样本存在较大肺腺癌远处转移的风险；所述肺腺癌抗PD
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L1免疫治疗疗效检测试剂盒，利用流式细胞术检测样品中标志物的含量进行判断，若样本中标志物小于其临界值范围，则初步判...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春翌，张宇琛，张坤鹏，古杰，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：