一种高灵敏度ELISA酶结合物的制备方法技术

本发明专利技术涉及ELISA试剂开发应用领域，具体涉及高灵敏度ELISA酶结合物的制备方法。本发明专利技术提供了酶结合物和其制备方法，所述酶结合物为结合抗体的乳胶微球经HRP

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏度ELISA酶结合物的制备方法


[0001]本专利技术涉及ELISA试剂开发应用领域，具体涉及高灵敏度ELISA酶结合物的制备方法。

技术介绍

[0002]现有ELISA提高灵敏度的方式是生物素
‑
亲和素放大系统，即通过大量生物素结合于抗体上，再利用SA
‑
HRP与抗体上的生物素结合，形成Ab
‑
SA
‑
HRP对底物进行催化，所述生物素
‑
亲和素的放大系统，是基于一个亲和素可结合4个生物素的情况下进行的。但在实际ELISA运用中，由于生物素标记抗体在反应结束后会进行清洗，洗去多余游离的生物素化抗体，仅保留结合在板孔中的生物素化抗体。此时再加入SA
‑
HRP，该SA仅能结合到1个生物素，因此该模式并未能真正放大反应灵敏度，在实际运用中，该放大系统并没有显著的放大效果。因此开发一种灵敏度更高的酶结合物用于ELISA检测具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供高灵敏度ELISA酶结合物的制备方法。
[0004]本专利技术提供了酶结合物，其为偶联BSA
‑
HRP复合物和抗体的乳胶微球；其中，
[0005]BSA
‑
蛋白酶复合物中，所述蛋白酶包括葡萄糖氧化酶、β
‑
D
‑
半乳糖苷酶、脲酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶中的至少一种；
[0006]所述免疫原性蛋白包括抗体或抗原；
[0007]所述微球包括聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、四氧化三铁微球、脲醛树脂微球或γ
‑
Fe2O3微球中的至少一种；
[0008]所述BSA
‑
蛋白酶复合物与免疫原性蛋白的物质的量比为12:1。
[0009]进一步的，本专利技术所述的酶结合物中，所述乳胶微球为羧基乳胶微球。
[0010]所述BSA
‑
蛋白酶复合物中，所述蛋白酶为辣根过氧化物酶；
[0011]所述免疫原性蛋白为抗体；
[0012]所述微球为聚苯乙烯微球；
[0013]所述聚苯乙烯微球表面基团包括氨基、羧基或EpoxySiOH中的至少一种；
[0014]所述苯乙烯微球的直径为0.5～5μm。
[0015]更进一步的，所述微球为羧基聚苯乙烯微球，直径为0.2μm。
[0016]本专利技术中，所述免疫原性蛋白包括抗体或抗原，当用于检测样本中抗体时，所述免疫原性蛋白为抗原；当用于检测抗原时，所述免疫原性蛋白为抗体；所述抗原或抗体的来源包括但不限于羊、人、小鼠、大鼠、鸡、兔、猪，本专利技术对此不作限定；本专利技术所述的抗体或抗原可以为靶向任意疾病或生理检测目标物的抗原或抗体，本领域技术人员可根据实际需要进行替换。
[0017]本专利技术的具体实施例中，通过将抗体蛋白固定在微球上，且同时微球上结合有大
量的HRP，因此在洗去游离抗体
‑
微球后，被结合的抗体
‑
微球结合物仍含有远大于抗体
‑
HRP结合物的HRP数量，因此灵敏度较抗体直接偶联HRP有较大的提升。
[0018]本专利技术提供了所述的酶结合物的制备方法，其为免疫原性蛋白与微球的偶联物经第一封闭、洗涤和第二封闭制得；
[0019]所述第一封闭的试剂为HRP
‑
BSA复合液，所述HRP
‑
BSA复合液中含有HRP
‑
BSA复合体；所述第一封闭时间为30min；
[0020]所述洗涤液为MES缓冲液；
[0021]所述第二封闭的试剂为含有1wt％HO
‑
PEG
‑
NH2的水溶液，第二封闭的时间为30min；
[0022]所述第一封闭后还包括离心的步骤，所述离心的条件为12000r离心30min；
[0023]MES缓冲液包括水和50mM的2
‑
(N
‑
吗啡啉)乙磺酸，pH为7.0；
[0024]进一步的，本专利技术所述的制备方法中，
[0025]所述HRP
‑
BSA复合液为将BSA溶液、CB缓冲液和HRP混合液混合后反应制得；
[0026]所述BSA溶液的溶剂为水，所述BSA溶液中BSA的浓度为5mg/mL；
[0027]所述CB缓冲液包括水、6.36g/mL的碳酸钠和11.72g/mL的碳酸氢钠，pH为9.6；
[0028]所述反应的条件为室温避光反应2h；
[0029]所述BSA溶液、CB缓冲液和HRP混合液的体积比为10：10：9。
[0030]更进一步的，所述HRP
‑
BSA复合液的制备中，
[0031]HRP混合液为HRP酶溶液与高碘酸钠溶液反应后加入乙二醇溶液获得；
[0032]所述HRP酶溶液的溶剂为水，所述HRP酶溶液中HRP酶的浓度为5mg/mL；
[0033]所述高碘酸钠溶液的溶剂为水，所述高碘酸钠溶液中高碘酸钠的浓度为0.03M；
[0034]所述乙二醇溶液的溶剂为水，所述乙二醇溶液中乙二醇的浓度为0.32M。
[0035]所述HRP混合液中HRP酶溶液、高碘酸钠溶液和乙二醇溶液加入的体积比为4：2：2。
[0036]通过物理吸附、化学键偶联等方式将抗体固定在乳胶微球上，并将BSA偶联的HRP作为封闭剂同时包被在乳胶微球上。这样既保证了抗体的天然结构不受HRP结合的影响，同时将多个HRP固定在抗体周边用于底物的催化。实际运用过程中，当微球通过抗体与ELISA板孔中的目标蛋白发生特异性结合被固定在半空中，在利用微球上大量的HRP对底物进行催化产生有色信号或发光信号。该方法在保证抗体活性的情况，大大加大了抗体周边的HRP的数量，从而提高了ELISA检测的灵敏度，实验结果表明，本专利技术所述的酶结合物和本专利技术所述的制备方法制得的酶结合物用于样品的检测，检测的灵敏度显著高于其他酶结合物的ELISA试剂盒。
[0037]本专利技术提供了如下I)～II)所示中的至少一种在制备ELISA产品中的应用：
[0038]I)、本专利技术所述的酶结合物；
[0039]II)、本专利技术所述的制备方法制得的含有酶结合物的产物；
[0040]本专利技术提供了免疫检测的制剂，其包括辅料和如下i)～ii)所示中的至少一种：
[0041]i)、本专利技术所述的酶结合物；
[0042]ii)、本专利技术所述的制备方法制得的含有酶结合物的产物；
[0043]进一步的，所述辅料包括捕获蛋白、发光底物、前处理液或检测缓冲液中的至少一种。
[0044]本专利技术中，所述的捕获蛋白可以为抗体或抗原，其与微球上包被的抗体或抗原配套，用于样品的免疫检测。
[0045]本专利技术中，所述辅料用于维持酶结合物的活性或帮助酶结合物发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.酶结合物，其为结合有BSA
‑
蛋白酶复合物和免疫原性蛋白的微球；其中，BSA
‑
蛋白酶复合物中，所述蛋白酶包括葡萄糖氧化酶、β
‑
D
‑
半乳糖苷酶、脲酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶中的至少一种；所述免疫原性蛋白包括抗体或抗原；所述微球包括聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、四氧化三铁微球、脲醛树脂微球或γ
‑
Fe2O3微球中的至少一种；所述BSA
‑
蛋白酶复合物与免疫原性蛋白的物质的量比为12:1。2.根据权利要求1所述的酶结合物，其特征在于，所述BSA
‑
蛋白酶复合物中，所述蛋白酶为辣根过氧化物酶；所述免疫原性蛋白为抗体；所述微球为聚苯乙烯微球；所述聚苯乙烯微球表面基团包括氨基、羧基或EpoxySiOH中的至少一种；所述聚苯乙烯微球的直径为0.5～5μm。3.根据权利要求1或2所述的酶结合物，其特征在于，所述微球为羧基聚苯乙烯微球，直径为0.2μm。4.权利要求1～3任一项所述的酶结合物的制备方法，其特征在于，其为免疫原性蛋白与微球的偶联物经第一封闭、洗涤和第二封闭制得；所述第一封闭的试剂为HRP
‑
BSA复合液，所述HRP
‑
BSA复合液中含有HRP
‑
BSA复合体；所述洗涤液为MES缓冲液；所述第二封闭的试剂为含有1wt％HO
‑
PEG
‑
NH2的水溶液。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：马伟民，肖川，许元峰，
申请(专利权)人：湖南芯辰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：