一种大疱性类天疱疮诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术属于试剂检测技术领域，公开了一种大疱性类天疱疮诊断试剂盒。包括所述试剂盒组成包括人表皮抽提物蛋白条、BP180NC16a重组蛋白条、阳性对照、酶标IgG抗体、酶标IgA抗体、反应缓冲液、清洗缓冲液、酶基质液。本发明专利技术把复杂的免疫印迹技术简单化，同时使用人表皮抽提物和BP180NC16a重组蛋白作为抗原，且同时分析IgG和IgA自身抗体，具有敏感性高、特异性好、节省时间、操作简单、不需要特殊的检测设备、和结果判定容易等特点，一次性全面解决了大疱性类天疱疮的血清学诊断问题。天疱疮的血清学诊断问题。

【技术实现步骤摘要】
一种大疱性类天疱疮诊断试剂盒


[0001]本专利技术属于试剂检测
，具体涉及一种大疱性类天疱疮诊断试剂盒。

技术介绍

[0002]大疱性类天疱疮是类天疱疮的一个主要的亚型，临床表现以皮肤损伤为主，部分患者伴有黏膜损伤。大疱性类天疱疮单纯依靠临床表现无法进行诊断，必须要依靠患者血清中BP180和/或BP230的自身抗体的检出才能确诊。
[0003]目前，临床上主要依赖可以检测NC16a(BP180蛋白的一部分)IgG自身抗体的ELISA试剂盒进行血清学诊断；另外，实验室使用的商品化的检测BP230(只是部分蛋白，不是全长)IgG自身抗体的ELISA试剂盒，可以作为大疱性类天疱疮的诊断参考。但是，目前针对BP180和BP230的自身抗体的检测，最敏感的方法依然是人表皮抽提物作为抗原的免疫印迹法
[1,2]。由于人表皮抽提物作为抗原的免疫印迹法在国际和国内也只有非常少数的实验室掌握，且多数实验室也只进行IgG抗体的检测。导致大疱性类天疱疮的误诊漏诊问题频发，进而导致不能给予正确的治疗手段。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种大疱性类天疱疮诊断试剂盒，本专利技术在多年实践经验的基础上建立大疱性类天疱疮检测试剂盒，可同时检测BP180和BP230的IgG和IgA自身抗体，因此能一次性全面解决大疱性类天疱疮在国内外临床上难于诊断的问题。
[0005]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种大疱性类天疱疮诊断试剂盒，所述试剂盒组成包括人表皮抽提物蛋白条、BP180NC16a重组蛋白条、阳性对照、酶标IgG抗体、酶标IgA抗体、反应缓冲液、清洗缓冲液、酶基质液；其中所述阳性对照成分为含BP180和BP230IgG双阳性抗体血清稀释于含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，含量为1ml；酶标IgG抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体，含量为2.0ml；酶标IgA抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgA抗体，含量为1.0ml；反应缓冲液为含0.05％v/v Tween20和0.05％w/vNaN3的1xPBS，含量为2.0ml；清洗缓冲液为含0.5％v/vTween20的10xPBS，含量为10ml、酶基质液为TMB和H2O2混合溶液，含量为3.0ml，其中TMB使用无水乙醇溶解，浓度为2.5mg/ml，H2O2浓度为0.03％体积比。
[0006]进一步的，所述人表皮抽提物蛋白条、BP180NC16a重组蛋白条制备方法为：取2μg人表皮抽提物蛋白或BP180NC16a重组蛋白与300μl 4倍浓缩的蛋白上样缓冲液混合，100度煮样5分钟，冰上静置1分钟，瞬离收集人表皮抽提物蛋白或BP180NC16a重组蛋白样本至管底。使用7.5％的PAGE胶(一孔胶)，加入全部人表皮抽提物蛋白/BP180NC16a重组蛋白样本、在20mA条件下电泳3小时；电泳后，使用iBlot2NC regulartransfer stack(Thermofisher公司)在iBlot2设备上(Thermofisher公司)进行转膜，转膜时间7分钟；取出转入蛋白的NC膜，纵向切成5mm宽的蛋白条，蛋白条使用5％脱脂牛奶(反应缓冲液稀释)进行室温封闭1小
时，然后用清洗缓冲液清洗3次(每次3分钟)，室温干燥，即为本专利技术中所使用的蛋白条，其中所述4倍浓缩的蛋白上样缓冲液成分为2.4wt％Tris，8wt％SDS，0.1wt％溴酚蓝，1.5wt％DTT，40v/v％glycerol，余量为水。
[0007]进一步的，所述大疱性类天疱疮诊断试剂盒设有6条染色槽，其中三条染色槽含有人表皮抽提物蛋白条，另三条染色槽含有BP180NC16a重组蛋白条。
[0008]进一步的，所述染色槽在加入蛋白条前注入上述反应缓冲液稀释至5％的脱脂牛奶在室温下封闭1小时，然后使用上述清洗缓冲液洗净后晾干。
[0009]以BP180NC16a重组蛋白作为抗原为例。本方法使用BP180NC16a重组蛋白作为抗原，利用免疫印迹检测人血清中BP180的自身抗体。检测时，阳性对照血清以及可疑患者血清分别加入到对应的蛋白条上，血清中BP180的IgG/IgA抗体会与抗原结合。洗涤后，去除未结合的血清蛋白，然后蛋白条上结合的人IgG/IgA抗体与辣根过氧化物酶标记的抗人IgG/IgA抗体结合，再次洗涤后，蛋白条上结合的辣根过氧化物酶与底物反应，形成肉眼可见的粉色条带，即可判断为阳性，无条带出现即可判断为阴性。
[0010]本专利技术与现有技术相比的有益效果是：本专利技术把复杂的免疫印迹技术简单化，同时使用人表皮抽提物和BP180NC16a重组蛋白作为抗原，且同时分析IgG和IgA自身抗体，具有敏感性高、特异性好、节省时间、操作简单、不需要特殊的检测设备、和结果判定容易等特点，一次性全面解决了大疱性类天疱疮的血清学诊断问题。
附图说明
[0011]下面结合附图与具体实施方式对本专利技术作进一步说明
[0012]图1是应用本专利技术的大疱性类天疱疮诊断试剂盒检测可疑患者的结果示意图。
具体实施方式
[0013]下面通过具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。如无特殊说明，本专利技术所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
[0014]实施例1
[0015]一种大疱性类天疱疮诊断试剂盒，所述试剂盒组成包括
[0016]1.表皮抽提物蛋白条(3条，分别放置于其中3个染色槽中)
[0017]2.BP180NC16a重组蛋白条(3条，分别放置于另3个染色槽中)
[0018]3.阳性对照BP180和BP230IgG自身抗体双阳性的患者血清稀释于含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，1ml)
[0019]4.酶标IgG抗体(辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体，2.0ml)
[0020]5.酶标IgA抗体(辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgA抗体，1.0ml)
[0021]6.反应缓冲液(含0.05％v/v Tween20和0.05％w/vNaN3的1xPBS，2.0ml)
[0022]7.清洗缓冲液(含0.5％v/vTween20的10xPBS，10ml)
[0023]8.酶基质液(3，3
’
，5，5
’‑
四甲级联苯胺二氢氯化物/过氧化氢(TMB/H2O2)溶液，TMB浓度为2.5mg/ml(无水乙醇溶解)，H2O2浓度为0.03％(V/V)，共5.0ml)
[0024]本专利涉及的三种蛋白，其中表皮抽提物为实验室自行准备，具体方法参照文献
[3]；BP180NC16a重组蛋白是通过原核表达纯化的。
[0025]蛋白条的制备以LM332重组蛋白为例：取2μg总蛋白与300μl 4倍浓缩的蛋白上样缓冲液混合，100℃条件下煮样5分钟，冰上静置1分钟，瞬离收集蛋白样本至管底。使用7.5％的PAGE胶(一孔胶)，加入全部样本、电泳(条件：20mA，3小时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大疱性类天疱疮诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组成包括人表皮抽提物蛋白条、BP180NC16a重组蛋白条、阳性对照、酶标IgG抗体、酶标IgA抗体、反应缓冲液、清洗缓冲液、酶基质液；其中所述阳性对照成分为含BP180和BP230IgG双阳性抗体血清稀释于含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，含量为1ml；酶标IgG抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体，含量为2.0ml；酶标IgA抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgA抗体，含量为1.0ml；反应缓冲液为含0.05％v/vTween20和0.05％w/vNaN3的1xPBS，含量为2.0ml；清洗缓冲液为含0.5％v/vTween20的10xPBS，含量为10ml、酶基质液为TMB和H2O2混合溶液，含量为3.0ml，其中TMB使用无水乙醇溶解，浓度为2.5mg/ml，H2O2浓度为0.03％体积比。2.根据权利要求1所述的大疱性类天疱疮诊断试剂盒，其特征在于，所述人表皮抽提物蛋白条、BP180NC16a重组蛋白条制备方法为：取2μg人表皮抽提物蛋白或BP180NC16a重组蛋白与300μl4倍浓缩的蛋白上样缓冲液混合，100度煮样5分钟，冰上静置1分钟，瞬离收集人表皮抽提物蛋白或BP180NC16a重组蛋白样本至管底。使用7...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小光，钱华，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：