一种副结核病亚单位疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种副结核病亚单位疫苗及其制备方法和应用。所述的疫苗中含有副结核分枝杆菌重组蛋白，所述的重组蛋白命名为66NC，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。实验证明本发明专利技术的一种副结核病亚单位疫苗可诱导小鼠产生高水平的IgG和IgM，可诱导脾脏淋巴细胞分泌高水平的IFN

【技术实现步骤摘要】
一种副结核病亚单位疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种副结核病亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于生物医药


技术介绍

[0002]副结核病(Paratuberculosis)又称约翰氏病(Johne
’
s diease，JD)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，MAP)引起的反刍动物慢性消耗性传染病，患病动物主要表现为顽固性腹泻、渐进性消瘦和增生性肠炎(OLSEN etal.,2002；WHITTINGTON et al.,2017)。该病主要感染牛、山羊和绵羊等反刍动物，但在野兔、狐狸、白鼬和鼬鼠等许多非反刍野生动物和灵长类动物中也能分离到MAP(BEARD et al.,2001；FECHNER etal.,2017)。目前副结核病在世界范围内广泛流行，是危害最严重的奶牛传染病之一，不仅造成奶牛产奶量下降，而且由于机体过度消瘦而被淘汰，给畜牧业造成巨大的经济损失(HEMPEL et al.,2016)。近年来，随着我国奶牛和肉牛养殖业发展规模不断扩大，副结核病的发病率也逐渐攀升，由副结核病造成的危害日益严重，因此必须引起政府和养殖业的高度重视。此外，MAP与人类的克罗恩病(一种与人类肠道慢性耗损相关的自身免疫疾病)存在某种潜在的联系(GARVEY,2018)，因此严重危害人类公共卫生安全。
[0003]副结核病疫苗主要分为三大类，包括—减毒活疫苗、全细胞灭活疫苗和亚单位疫苗。
[0004]Vall
é
e和Rinjard于1926年首次报道了针对MAP的疫苗接种，该疫苗是由减毒活MAP和油剂佐剂组成，此后大量减毒活疫苗被研制用于牛羊副结核病的预防。减毒活疫苗可以刺激先天免疫和适应性免疫，引发保护性粘膜免疫和全身免疫反应(GHOSH et al.,2014)。许多减毒候选疫苗主要通过转座子突变、等位基因交换和噬菌体介导等技术，降低MAP的毒力获得减毒株。2002年，新西兰和澳大利亚用316F MAP减毒株和油剂佐剂研制成的Neoparasec疫苗，被用于牛、羊副结核病的治疗及免疫预防(KOHLER et al.,2001)，但减毒活疫苗存在毒力返强的缺点。约翰氏疾病综合计划(JDIP)研究联盟建立了一个三阶段候选疫苗评估策略，以提高MAP减毒活疫苗效果测试的效率(BANNANTINE et al.,2014)。第一阶段是使用体外牛单核细胞衍生巨噬细胞(MDM)模型进行筛选。第二阶段是使用小鼠模型评价免疫保护效果，第三阶段是使用山羊模型评估免疫保护效果。Lamont等用MDM模型，评估了2014年之前构建的许多候选减毒活疫苗，该候选疫苗评估策略的建立为筛选保护效果好的减毒活疫苗提供了技术支撑(LAMONT etal.,2014)。
[0005]MAP全细胞灭活疫苗包括Mycopar、Gudair和Silirum，由灭活的MAP菌株与油剂佐剂混合研制成的疫苗，但只有Mycopar在美国被批准为一种商用疫苗。该商用疫苗可将副结核病的临床疾病发生率降低了90％，虽然为副结核病的控制提供了有效措施，但接种疫苗的动物仍然会被感染，并在粪便中可检测到MAP，且全细胞灭活疫苗会对动物注射部位造成损伤(EPPLESTON WINDSOR,2007；ROSSEELS HUYGEN,2008)。接种疫苗的动物，从注射时造成的损伤到恢复可能需要数月时间，并且需要多次治疗，通常可能还需要手术才能痊愈。疫苗
接种部位的损伤被认为是由于佐剂、抗原和宿主免疫反应之间相互作用的结果。研究发现，和其他MAP灭活疫苗注射部位损伤可能是由于使用不同的佐剂造成的，高度精炼的矿物油作为佐剂研制的灭活苗与用弗氏佐剂相比，能减少注射部位的损伤(WINDSOR etal.,2005)。
[0006]亚单位疫苗的研发是使用定义明确的重组MAP蛋白或编码免疫原性抗原的DNA，MAP的亚单位疫苗可能会消除全细胞疫苗的一些缺点，例如注射部位的严重炎症和肉芽肿形成。由Th1介导的免疫应答诱导的IFN
‑
γ对减少MAP感染早期的细菌数量至关重要，因此识别诱导强烈Th1应答的抗原对于亚单位疫苗的开发至关重要。P22蛋白属于分枝杆菌脂蛋白LppX/LprAFG家族。该蛋白当作为重组蛋白在油包水乳剂中，能诱导较强的IFN
‑
γ水平和抗体反应(RIGDEN etal.,2006)。PPE家族的两种MAP蛋白，即MAP1518和MAP3184，可在实验感染的荷斯坦犊牛的PBMC细胞悬液中诱导显著的IFN
‑
γ水平(NAGATAet al.,2005)。此外，Ag85复合物、HSP65、HSP70研制的亚单位疫苗能诱导显著的IFN
‑
γ水平，是MAP疫苗的候选抗原(ROSSEELS HUYGEN,2008)。
[0007]理想的MAP疫苗是完全防止感染，从而阻断水平和垂直传播。现有的副结核病疫苗远远达不到这一标准。MAP疫苗已被证明在降低粪便中细菌脱落水平、组织菌落定殖或临床疾病发病率方面有效，但并不能完全消除这三种情况(STRINGER et al.,2013)。长期以来，由于缺乏标准化的感染模型以及在天然绵羊、山羊、鹿或牛宿主中进行的试验成本高昂，改进现有疫苗配方的努力一直受到阻碍。然而，目前由国际研究人员在约翰氏病综合计划(JDIP)的支持下开发的约翰氏病的标准化动物模型(小鼠、山羊和奶牛)帮助促进不同疫苗试验之间的比较(HINES et al.,2007)。然而，MAP疫苗试验的成本，尤其是在自然宿主中，仍然是一个主要问题。即使使用有效的疫苗，由于垂直传播，MAP也很有可能在群体内存在(LU et al.,2013)。
[0008]本专利技术依据MAP的map3527、map1609c和Hsp70三个基因，分别构建了四种重组质粒，在表达和纯化四种重组蛋白基础上，联合不同的佐剂在小鼠模型中，通过IFN
‑
γELISPOT实验筛选出最佳佐剂和最佳免疫原，并在小鼠模型中进行免疫原性、安全性和免疫保护效果的评价，从而为副结核病的有效防控奠定基础。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种副结核病亚单位疫苗及其制备方法和应用。
[0010]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0011]本专利技术依据MAP的map3527、map1609c和Hsp70三个基因，分别构建了四种重组质粒，转入大肠杆菌BL21并成功表达，根据蛋白大小分别命名为66CN、66NC、90CN和90NC，经Ni柱亲和层析纯化后获得四种高纯度的重组蛋白。选取MONTANIDE ISA 61VG、MONTANIDE ISA206 VG和MONTANIDE GEL 02PR三种佐剂，分别与66NC重组蛋白乳化后经皮下和肌肉2种途径免疫小鼠，以IFN
‑
γELISPOT实验确证61VG为最佳佐剂、皮下为最佳免疫途径。将4种重组蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种副结核病亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物中含有副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，MAP)重组蛋白，所述的重组蛋白命名为66NC，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的副结核病亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物中还含有佐剂，优选的，所述的佐剂为MONTANIDE ISA61 VG。3.如权利要求1所述的副结核病亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述的重组蛋白66NC是通过以下方法制备得到：(1)重组质粒的构建1)pET
‑
28a
‑
3527C
‑
3527N和pET
‑
28a
‑
3527N
‑
3527C重组质粒的构建以MAPK
‑
10参考株基因组DNA为模板，以引物3527NN
‑
F/R、3527CC
‑
F/R进行PCR扩增，分别得到片段map3527N以及map3527C；3527NN
‑
F:GCTCCGTCGACAAGCTTGCGCACCGTCGGGCCTGGCGCT(HindⅢ)3527NN
‑
R:GTGGTGGTGGTGCTCGAGTGGCGGTGTCCACGCCGATCACCT(XhoⅠ)3527CC
‑
F:AGCTCCGTCGACAAGCTTGCACCGCCGCCACCGACAGCT(HindⅢ)3527CC
‑
R:TGGTGGTGGTGCTCGAGTGGCCGGCGGCCCCTCCGCCA(XhoⅠ)Hsp70NC
‑
F:CGGCGTGGACACCGCCGAATTCATGAGAGTCGGAATCGACTTCGG C(EcoRⅠ)Hsp70NC
‑
R GGTGGCGGCGGTGCAAGCTTGGCTCGCCGATGCGCACCGCTC(HindⅢ):2)pET
‑
28a载体经NdeⅠ和EcoRΙ双酶切后与map3527N连接，获得pET
‑
28a
‑
3527N质粒，该质粒经HindⅢ和Xho I双酶切后与map3527C连接，获得pET
‑
28a
‑
3527N
‑
3527C质粒；3)Hsp70NC基因的扩增以MAPK
‑
10参考株基因组DNA为模板，以引物Hsp70NC
‑
F/R进行PCR扩增，得到Hsp70NC片段；4)pET
‑
28a
‑
3527N
‑
Hsp70
‑
3527C重组质粒的构建pET
‑
28a
‑
3527N
‑
3527C重组质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后与Hsp70NC片段连接，获得pET
‑
28a
‑
3527N
‑
Hsp70
‑
3527C；(2)66NC蛋白的诱导表达将鉴定正确的菌液，离心弃上清，留菌体沉淀用质粒提取试剂盒提取重组质粒，通过化学转化法测序正确的重组质粒pET
‑
28a
‑
3527N
‑
Hsp70
‑
3527C转化至E.coli BL21感受态细胞中，37℃，180rpm/min复苏1h，8000rpm/min离心10min，弃上清，将细胞沉淀均匀涂布于含有50ug/mL卡那霉素的LB固体培养基中，于37℃温箱中培养12h以上；于LB固体培养基中挑取单菌落接种于含有50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm/min培养12h以上；取100...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘思国，党光辉，邵明珠，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：