一种治疗用卡介苗菌体的分散、冻干方法及原液、半成品、成品技术

本发明专利技术属于疫苗制备领域，具体公开了一种治疗用卡介苗菌体的分散、冻干方法及原液、半成品、成品，通过将15g～20g菌体分散到125g～167g冻干保护剂中，获得1单位重量菌悬液浓度为120mg/mL～140mg/mL的治疗用卡介苗原液；采用冻干保护剂将治疗用卡介苗原液分散1.8～2.5倍，混合均匀，得1单位重量治疗用卡介苗半成品；1单位重量治疗用卡介苗半成品中卡介菌浓度为48～72mg/mL。本发明专利技术制备的治疗用卡介苗冻干产品的质量远高于《中国药典》三部要求的标准，经试验证明，本发明专利技术涉及的治疗用卡介苗活菌数也大大提高，具有更高的初始活菌数和热稳定性，并由此有可能降低灌注剂量，缓解该类制品短缺问题。类制品短缺问题。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗用卡介苗菌体的分散、冻干方法及原液、半成品、成品


[0001]本专利技术属于疫苗制备领域，特别涉及一种治疗用卡介苗菌体的分散、冻干方法及原液、半成品、成品。

技术介绍

[0002]治疗用卡介苗是采用卡介菌经培养收集菌体，制备高浓度卡介菌菌悬液，加入稳定剂冻干制成的制剂。目前全球有5款产品已上市，而因为监管、成本和设备等因素，北美和欧洲主要供应商赛诺菲于2017年宣布正式退出该市场，导致全球治疗用BCG处于短缺状态。当前冻干制品稳定性最高可以保持18个月，实践运用中18个月效期仍不能满足实际市场需求，产品的货架期较短，因此生产高质量及稳定性好的治疗用卡介苗是一项具有挑战的工作。
[0003]目前已上市的必赛吉治疗用BCG用卡介菌经培养后收集菌体，加入稳定剂分装至安瓿中冻干制成的免疫治疗剂，采用冻干保护剂为蔗糖、明胶、谷氨酸钠、氯化钾，冻干生产工艺与预防结核病用卡介苗相同(《中国药典》现行版)为行业内公认，而治疗用卡介苗制品质量指标之一卡介菌活菌数及活菌数的稳定性是影响免疫效果的关键因素，每瓶含卡介菌60mg，每1mg卡介菌含活菌数为1.0
×
106CFU，活菌数的质量仅能满足《中国药典》现行版三部要求“不低于1.0
×
106CFU/mg”的最低标准；且内包材采用安瓿，一方面因包材直立时稳定性差，冻干时半成品分装后进出冻干机无法做到自动进出，只能采用手动进出冻干机，不符合自动化生产要求，为产品安全带来风险，另一方面与国际上该类产品采用的主流包材西林瓶存在差距。
[0004]目前，现有技术中对卡介菌的研究中，多针对卡介菌的冷冻和冷冻干燥技术研究中保护剂处方研究和冻干工艺研究。例如公开号为CN106754376A的专利提出了涉及一种微生物低温保存保护剂，及其制备方法和用途；其中微生物低温保存保护剂的成分为：还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐、谷氨酸盐和水；同时建立了卡介菌低温长期保存的技术方法，为深入开展卡介菌的相关研究提供了技术支撑；但治疗用卡介苗剂型基本都是采用注射用冻干剂型，液体冷冻稳定性差，不能满足临床使用要求。公开号为CN1218750C的专利公开了治疗用卡介苗的保护剂和冻干工艺，制备联合疫苗具有强免疫原性；公布重组hIFN
‑
α
‑
2b
‑
BCG冻干保护剂处方：10％蔗糖、1％明胶、1％谷氨酸钠、1％氯化钾，冻干制剂活菌率高，满足生物免疫治疗标准，生物学特性和质粒具有稳定性。公开号为CN111588859A的专利提出了一种冻干保护剂及其应用和冻干苗及其制备方法，冻干保护剂各成分配制浓度为：蔗糖10％、右旋糖酐0.5～2.0％、谷氨酸钠1％、KCL1％，或者是蔗糖10％、右旋糖酐1％、海藻糖1～5％、谷氨酸钠1％、KCL1％，配制冻干保护剂的溶剂为注射用水，用10％氢氧化钠溶液调节冻干保护剂的pH值为7.3～7.5。但采用该专利方法制备的治疗用稳定性研究结果显示有效质量的时间为3个月，远远低于上市品18个月的最长效期。菌体采用保护剂分散后，半成品菌体浓度为120mg/mL。综上可以看出，菌体在保护剂中的分散方式的研究未见涉
及。
[0005]现有的卡介苗冷冻干燥工艺一般包括冷冻、第一阶段升华干燥(一次干燥)和第二阶段解析干燥(二次干燥)三个步骤，研究表明冷冻和一次干燥是冷冻干燥过程中最关键的阶段之一。上述冷冻干燥工艺未考虑到治疗用卡介苗是一种高浓度、冻干活菌制剂，制剂处方中固态物质含量(有效成分和非有效成分含量总和)为19％(g/g)，而半成品中冻干保护剂成分及比例、菌体在保护剂中的分散方式及冻干工艺对制品冻干后活菌数含量及耐热耐存放的稳定性具有重要影响。另有冻干工艺采用常规的快速降温办法，该方法中同一瓶制品与层板接触的底层与面层的温度相差较大，底层已经达到产品共晶点而面层还相差较远，出现瞬间从底部向面层形成结晶然后再溶解、再结晶的反复冻融现象。从而造成同一瓶制品不同层的溶液浓度不一样，在面层形成高浓度的盖子，不利于产品预冻后的升华，容易造成物理性状不好、形成较大晶体、光亮的面层、底部萎缩等现象，反复冻融会对所冻菌体造成机械损伤。从而导致产品冻干损失大，活菌数测定结果显示虽不低于1.0
×
106CFU/mg，但数值达到临界值，有不合格的风险。因此冷冻阶段通常采用梯度降温，例如公开号为CN107543373A的专利中提出了一种活疫苗的冷冻干燥方法，在冷冻后和干燥步骤之间引入退火处理，获得的制品没有大冰晶，易于升华获得良好的产品物理性状和效价，并改善同一瓶及不同瓶间不均匀性和干燥速率，提高非晶项冻结浓缩液的玻璃化转变温度，从而提高制品的稳定性。一次干燥阶段，大部分水在这一阶段被升华；解析干燥阶段是为除去残余的水分，因治疗用卡介苗为活菌制剂，若控制不好，会直接影响产品的外观、水分、活菌数质量和稳定性。治疗用卡介苗公认的冻干工艺和公开号为CN111588859A的专利中都公开了相关阶段常规控制方法，但均未考虑对制品活菌数和耐热稳定性影响，从而影响活菌数或稳定性。
[0006]综上可知，目前公开有关治疗用卡介苗的半成品的浓度为120mg/mL，未公开任何在原液及半成品制备过程中有关菌体分散的控制方法，而本专利技术需要找到的不仅是一种通过菌体分散制备半成品方法，而且需要找到替代现有技术的含退火步骤的一种治疗用卡介苗冻干方法，以解决其质量或稳定性不高的缺点外，还需要在此基础上，获得一种能缓解当前短缺，更加具有产业化规模、安全的一种治疗用卡介苗。

技术实现思路

[0007]针对上述问题，第一方面，本专利技术提出了一种治疗用卡介苗菌体的分散方法，所述分散方法通过将15g～20g菌体分散到125g～167g冻干保护剂中，获得1单位重量菌悬液浓度为120mg/mL～140mg/mL的治疗用卡介苗原液；
[0008]采用冻干保护剂将所述治疗用卡介苗原液分散1.8～2.5倍，混合均匀，得1单位重量治疗用卡介苗半成品；
[0009]所述1单位重量治疗用卡介苗半成品中卡介菌浓度为48～72mg/mL。
[0010]进一步地，所述冻干保护剂包括蔗糖10％、明胶1％、谷氨酸钠1％、氯化钾1％和余量的注射用水。
[0011]进一步地，获得治疗用卡介苗原液包括以下步骤：
[0012]将15g～20g卡介苗菌体按照与1000g钢珠的质量比进行研磨；
[0013]研磨后加入125g～167g冻干保护剂，混匀10分钟，获得治疗用卡介苗原液。
[0014]更进一步地，研磨条件为：转速180～200r/min、时间3～5min。
[0015]进一步地，所述卡介苗菌体和冻干保护剂的质量比为17～20g：125g～135g。
[0016]进一步地，所述卡介苗菌体和冻干保护剂的质量比为19.8g：130g。
[0017]进一步地，所述1单位重量治疗用卡介苗半成品中卡介菌浓度为54～66mg/mL。
[0018]更进一步地，所述1单位重量治疗用卡介苗半本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种治疗用卡介苗菌体的分散方法，其特征在于，将15g～20g菌体分散到125g～167g冻干保护剂中，获得1单位重量菌悬液浓度为120mg/mL～140mg/mL的治疗用卡介苗原液；采用冻干保护剂将所述治疗用卡介苗原液分散1.8～2.5倍，混合均匀，得1单位重量治疗用卡介苗半成品；所述1单位重量治疗用卡介苗半成品中卡介菌浓度为48～72mg/mL。2.根据权利要求1所述的治疗用卡介苗菌体的分散方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括蔗糖10％、明胶1％、谷氨酸钠1％、氯化钾1％和余量的注射用水。3.根据权利要求1所述的治疗用卡介苗菌体的分散方法，其特征在于，获得治疗用卡介苗原液包括以下步骤：将15g～20g卡介苗菌体按照与1000g钢珠的质量比进行研磨；研磨后加入125g～167g冻干保护剂，混匀10分钟，获得治疗用卡介苗原液。4.根据权利要求3所述的治疗用卡介苗菌体的分散方法，其特征在于，研磨条件为：转速180～200r/min、时间3～5min。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的治疗用卡介苗菌体的分散方法，其特征在于，所述卡介苗菌体和冻干保护剂的质量比为17～20g：125g～135g。6.根据权利要求1
‑
4任一项所述的治疗用卡介苗菌体的分散方法，其特征在于，所述卡介苗菌体和冻干保护剂的质量比为19.8g：130g。7.根据权利要求1
‑
4任一项所述的治疗用卡介苗菌体的分散方法，其特征在于，所述1单位重量治疗用卡介苗半成品中卡介菌浓度为54～66mg/mL。8.根据权利要求1
‑
4任一项所述的治疗用卡介苗菌体的分散方法，其特征在于，所述1单位重量治疗用卡介苗半成品中卡介菌浓度为60mg/mL。9.一种如权利要求1所述的治疗用卡介苗原液，其特征在于，所述治疗用卡介苗原液重量为所述卡介苗原液1单位重量的1倍～120倍。10.一种如权利要求1所述的治疗用卡介苗半成品，其特征在于，所述治疗用卡介苗半成品重量为所述治疗用卡介苗半成品1单位重量的1倍～120倍。11.一种如权利要求1所述的治疗用卡介苗半成品的冻干方法，其特征在于，将治疗用卡介苗半成品在小于等于
‑
40℃预冷条件下进入冻干箱，全部进箱结束后保温不超过2h，依次进行退火、升华干燥和解析干燥，结束后压塞轧盖后制得治疗用卡介苗成品。12.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：江秋虹，张健，张保钱，王维为，朱战，徐守腾，梁永培，陶立峰，王国治，
申请(专利权)人：重庆智飞生物制品股份有限公司北京智飞绿竹生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：