一种模板DNA分子及其在制备mRNA和疫苗中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于体外转录的模板DNA分子，根据所述模板DNA分子转录获得的mRNA，其制备方法和mRNA在疾病预防和治疗中的应用，其中所述模板DNA分子依次包括启动子、5

【技术实现步骤摘要】
一种模板DNA分子及其在制备mRNA和疫苗中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种模板DNA分子及其在制备mRNA和疫苗中的应用。

技术介绍

[0002]mRNA疫苗的转录模板设计是成功制备mRNA疫苗的关键条件之一，其设计要点主要包括抗原编码区上游非翻译区(5
’
UTR)、下游非翻译区(3
’
UTR)以及多聚腺苷酸(polyA)尾巴。当前，mRNA疫苗转录模板设计专利主要为国外mRNA疫苗公司掌控，并且polyA尾巴的长度在100个以上，在使用质粒进行模板扩增过程中非常容易发生重组丢失。
[0003]mRNA不稳定易被降解，设计mRNA疫苗时要尽可能地保证后续生产出的mRNA具有较高的稳定性，mRNA的结构与其在细胞内的稳定性和表达效率密切相关。编码区两侧的UTR是mRNA结构中的关键区域，5
’
UTR及其帽子(Cap)结构是影响mRNA稳定性和翻译效率的重要因素，帽子结构既可保护mRNA免遭核酸酶的降解又能够参与到真核生物转录起始复合物的结合而影响翻译效率，5
’
UTR主要参与转录起始复合物的识别结合影响mRNA的翻译效率(Gray NK,et al.1998)。mRNA大部分的非稳定因素位于3
’
UTR，3'UTR序列和结构决定着mRNA的稳定性、定位和表达(Schlake T,et al.,2011；Goodarzi H,et al.,2012)。3
’
端polyA尾结构是除了5
’
端帽子以外对mRNA稳定性最重要的因素，大多数mRNA的降解是从polyA尾开始。
[0004]目前，国际上新型冠状病毒mRNA疫苗转录模板使用的大多是alpha和beta球蛋白(Globin)的UTR或是以此为基础改造的UTR，BioNTech公司使用了2个串联的beta球蛋白3
’
UTR和有间隔的120个腺苷酸的polyA尾来增强mRNA的稳定性，并申请了相关专利(US2019/0062762A1)。
[0005]然而以上mRNA表达载体不够稳定，而且过长的polyA也容易发生重组丢失。

技术实现思路

[0006]本专利技术提出了一种新的mRNA疫苗转录模板设计策略。通过该策略，能够实现高水平mRNA表达，且质粒扩增稳定，polyA尾巴不易发生重组丢失。具体的，
[0007]本专利技术第一方面，提供一种模板DNA分子，所述模板DNA分子包括5
’
端非翻译区(5
’
UTR)、目的多肽或蛋白编码区、3
’
端非翻译区(3
’
UTR)和多聚腺苷酸(polyA)区，所述UTR序列来源于人类基因组具有翻译功能的UTR。
[0008]优选的，所述5
’
UTR序列长度为20
‑
70bp，其序列结构要松散，不易形成二级结构。
[0009]优选的，所述5
’
UTR序列长度为20
‑
70bp范围内的任意范围或者任意整数数值，例如长度为22
‑
68bp，25
‑
65bp，28
‑
65bp，20、22、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70等等。
[0010]优选的，所述3
’
UTR序列包括50
‑
400bp，其序列结构要避免AU、AUUUA或GU富集序列。
[0011]更优选的，所述3
’
UTR序列长度为50
‑
400bp范围内的任意范围或者任意整数数值，例如长度为60
‑
380bp，70
‑
350bp，90
‑
300bp等等，例如50、55、60、67、75、90、106、130、150、175、200、220、249、275、300、320、360、375、390、400bp等等。
[0012]更优选的，所述5
’
UTR序列如SEQ ID NO:3、9
‑
14任一所示，所述3
’
UTR序列SEQ ID NO:6、15
‑
23任一所示。
[0013]在一个具体的实施方式中，所述5
’
UTR序列如SEQ ID NO:3所示，所述3
’
UTR序列SEQ ID NO:6、15
‑
23任一所示。
[0014]在一个具体的实施方式中，所述5
’
UTR序列如SEQ ID NO:3、9
‑
14任一所示，所述3
’
UTR序列SEQ ID NO:6所示。
[0015]优选的，所述polyA不超过100bp。所述polyA不超过100bp的任意数值，例如不超过100、95、90、85、80、79、78、76、75、72、70、68、65、63、60、58、56、54、52、50、49、48、46、45、43、41、40、39、37、35、33、31、30、29、28、25、23、20、17等等。
[0016]优选的，所述目的多肽或蛋白来源于任意生物体。
[0017]进一步优选的，所述目的多肽或蛋白来源于病毒、古细菌、原核生物、真核生物；更优选的，所述目的多肽或蛋白来源于病毒，例如水痘－带状疱疹病毒(varicella
‑
zoster virus，VZV)、新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒，或者，所述目的多肽或蛋白来源于动物或者人类疾病相关的抗原，例如变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原等等。
[0018]在一个具体的实施方式中，所述目的多肽或蛋白为水痘－带状疱疹病毒的gE蛋白或其突变体；或者新型冠状病毒S蛋白或其突变体、狂犬病毒CTN
‑
1毒株G蛋白(RVG)或其变体、呼吸道合胞病毒F蛋白或其突变体、流感病毒HA蛋白或其突变体、变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原等。
[0019]在一个具体的实施方式中，所述水痘－带状疱疹病毒的gE蛋白的编码序列如SEQ ID NO:25所示，或者SEQ ID NO:25的变体，所述变体具有编码gE蛋白的功能。
[0020]在一个具体的实施方式中，所述新型冠状病毒S蛋白的编码序列如SEQ ID NO:26所示，或者SEQ ID NO:26的变体，所述变体具有编码新型冠状病毒S蛋白的功能。
[0021]优选的，所述编码区本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种模板DNA分子，其特征在于，所述模板DNA分子包括5
’
端非翻译区(5
’
UTR)、目的多肽或蛋白编码区、3
’
端非翻译区(3
’
UTR)和多聚腺苷酸(polyA)区，所述UTR序列来源于人类基因组具有翻译功能的UTR。2.根据权利要求1所述的模板DNA分子，其特征在于，所述5
’
UTR序列长度为20
‑
70bp，其序列结构松散不易形成二级结构，所述3
’
UTR序列长度为50
‑
400bp，序列结构要避免AU、AUUUA或GU富集序列，优选的，所述5
’
UTR序列如SEQ ID NO:3、9
‑
14任一所示，所述3
’
UTR序列SEQ ID NO:6、15
‑
23任一所示。3.根据权利要求1
‑
2任一所述的模板DNA分子，其特征在于，所述polyA不超过100bp。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的模板DNA分子，其特征在于，所述模板DNA分子还包括5
’
帽子结构,优选的，所述5
’
帽子结构序列为标准帽子结构或修饰帽子结构。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的模板DNA分子，其特征在于，所述目的多肽或蛋白来源于任意生物体，优选的，来源于病毒、古细菌、原核生物、真核生物，更优选的，所述生物体来源于病毒，例如水痘－带状疱疹病毒(varicella
‑
zoster virus，VZV)，新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒，或者，所述目的多肽或蛋白来源于动物或者人类疾病相关的抗原，例如变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原，进一步优选的，所述目的多肽或蛋白包括水痘－带状疱疹病毒的gE蛋白或其突变体、新型冠状病毒S蛋白或其突变体、狂犬病毒CTN
‑
1毒株G蛋白(RVG)或其变体、呼吸道合胞病毒F蛋白或其突变体、流感病毒HA蛋白或其突变体、变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原。6.一种mRNA分子，其特征在于，所述mRNA分子由权利要求1
‑
5任一的模板DNA分子转录获得。7.根据权利要求6所述的mRNA分子，其特征在于，所述mRNA分子是天然或修饰的RNA。8.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求1
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱丙陶，杨世龙，王亚平，
申请(专利权)人：重庆智飞生物制品股份有限公司北京智飞绿竹生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：