一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1及其表达载体和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1及其表达载体和应用，涉及生物工程技术领域。本发明专利技术选择人Ⅲ型胶原蛋白α链154

【技术实现步骤摘要】
一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白
α
1及其表达载体和应用


[0001]本专利技术属生物工程
，具体为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1及其表达载体和应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质之一，占总蛋白质量的25％～30％，是人各种结缔组织中发现的细胞外基质中的主要结构蛋白。其参与许多人体器官组织的组成，如皮肤、角膜、神经视网膜、骨骼、肌肉等。Ⅲ型胶原蛋白是最丰富的一种原纤维胶原蛋白之一，是由三条α1(Ⅲ)链(Col3A1)形成的同源三聚体。皮肤中的Ⅲ型胶原蛋白随着年龄的增加会逐渐减少，从胎龄阶段的占比降至成年阶段的占比8％～11％。Ⅲ型胶原蛋白由成纤维细胞和其他间充质细胞类型分泌，这使其成为各种炎症相关病理学的主要参与者。如肺损伤，病毒性和非病毒性肝病，肾纤维化，疝气和血管疾病。Ⅲ型胶原蛋白和I型胶原蛋白是间质基质的主要成分，Ⅲ型胶原突变与先天性结缔组织发育不全综合征(Ehlers
‑
Danlos综合征)、血管缺陷以及主动脉和动脉瘤有关。Ⅲ型胶原蛋白除在护肤领域有广泛的应用，还有很多探索研究，有望拓展其前沿应用，如：利用人源Ⅲ型胶原制成的生物合成角膜光学透明，可替代供体疗法或转基因猪治疗方法，并无需使用免疫抑制药物；使用人源Ⅲ型胶原蛋白完成心脏瓣膜人工合成以及子宫内膜灌注修复；向肿瘤微环境中添加III型胶原蛋白，能够促进肿瘤细胞进入并维持在休眠状态，抑制肿瘤增殖。因此，Ⅲ型胶原蛋白潜在巨大的应用市场。
[0003]目前工业化使用的胶原蛋白主要是通过酸、碱或者酶法提取猪、牛等的皮肤或骨骼中的胶原蛋白，或是从深海鱼类的鱼皮中进行提取。从动物组织中提取胶原蛋白的技术虽然成熟，但存在着免疫原性和来源有限等，难以满足巨大的市场需求。随着基因工程技术的大规模应用，通过基因工程生成重组胶原蛋白成为解决胶原蛋白来源限制问题最有潜力的方法。与动物来源的胶原蛋白相比，重组胶原蛋白不仅具有生产周期短，成本低，适用于大规模生产的优势，还能避免动物蛋白免疫原性、动物源疾病等问题。因此重组胶原蛋白特别是重组人源胶原蛋白的制备是目前胶原蛋白生产研究的热点。
[0004]全长的胶原蛋白分子量大(100kDa)，且具有多种蛋白翻译后修饰，如脯氨酸、赖氨酸羟基化，糖基化等。当前国内生产重组Ⅲ型胶原蛋白选用的是大肠杆菌表达系统或是酵母表达系统，两种表达系统都具有能大规模表达的优势，但大肠杆菌表达的胶原蛋白，多为截短型，片段拼接型或是根据胶原蛋白序列特征人为改造，其与人体真实Ⅲ型胶原蛋白具有较大差异；酵母中蛋白翻译后修饰过程与人体存在差异，酵母表达系统得到的重组胶原蛋白与人体胶原蛋白存在较多不同。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1，所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合绿色荧光蛋白，具有很好的促进细胞迁移的活性，具有很大的应
用潜力。
[0006]本专利技术目的还在于提供一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的表达载体，本专利技术将人胶原蛋白α链154
‑
1221序列连接到优化后的载体pcDNA3.1上构建得到能够表达重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的表达载体。
[0007]本专利技术目的还在于提供一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的表达方法，采用人胚胎肾细胞Expi293F表达重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1链，并使用融合表达质粒提高蛋白表达量，实现Ⅲ型人源化胶原蛋白α1链全长区段表达。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1，所述编码重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]本专利技术还提供了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的表达载体，所述表达载体包含所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1、分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白基因序列及TEV酶切序列的DNA。
[0011]优选地，所述表达载体通过如下方式制备得到：所述表达载体通过如下方式制备得到：将所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1、分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白基因序列及TEV酶切序列的DNA，经过密码子优化后，合成的基因插入质粒pcDNA3.1的NheI和XhoI两个酶切位点之间，构成表达载体pcDNA3.1
‑
GFP
‑
CAL3A1。
[0012]更优选地，所述分泌信号肽为α
‑
甘露糖苷酶信号肽。
[0013]本专利技术提供了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白的表达方法，将所述表达载体转染至人胚胎肾细胞Expi293F中表达。
[0014]优选地，所述人胚胎肾细胞Expi293F的培养方法包括如下步骤：将人胚胎肾细胞Expi293F于37℃，110rpm，湿度80％，二氧化碳7％的摇床中预先悬浮培养，培养基采用无血清培养基。
[0015]优选地，当培养人胚胎肾细胞Expi293F的细胞密度达到2.5～3.0
×
106/mL，活细胞率>95％时，进行转染。
[0016]本专利技术还提供了一种所述表达方法获得的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白，所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017]本专利技术还提供了一种所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1或所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白在制备促进细胞迁移活性产品中的应用。
[0018]本专利技术还提供了一种所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1或所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白在制备皮肤修复产品中的应用。
[0019]相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0020]本专利技术选择人胶原蛋白α链154
‑
1221基因序列连接到载体pcDNA3.1上，通过在目的蛋白N端添加分泌信号肽和绿色荧光蛋白，优化表达载体，优化后的表达载体转染人胚胎肾细胞Expi293F，分泌表达可溶性绿色荧光蛋白融合的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1。本专利技术绿色荧光蛋白和重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的融合蛋白有促进α1BALB/c3T3细胞迁移的活性。经试验表明，作用6小时，100μg/mL重组胶原蛋白实验组(划痕恢复率为49％)与对照组(划痕恢复率为14％)相比，表现出明显促进细胞迁移的活性。作用12小时，实验组(100μg/mL)划痕恢复率为96％，远高于对照组38％。活性研究表明，本专利技术所表达的绿色荧光蛋白
融合的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1具有很好的促进细胞迁移的活性，具有巨大的应用潜力。
附图说明
[0021]图1为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合绿色荧光蛋白表达载体图谱；
[0022]图2为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合绿色荧光蛋白的SDS
‑
PAGE电泳图；
[0023]图3为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合绿色荧光蛋白促进细胞迁移实验结果图；
[0024]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1，其特征在于，所述编码重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1、分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白基因序列及TEV酶切序列的DNA。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体通过如下方式制备得到：将所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1、分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白基因序列及TEV酶切序列的DNA，经过密码子优化后，合成的基因插入质粒pcDNA3.1的NheI和XhoI两个酶切位点之间，构成表达载体pcDNA3.1
‑
GFP
‑
CAL3A1。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述分泌信号肽为α
‑
甘露糖苷酶信号肽。5.一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白的表达方法，其特征在于，将权利要求2所述表达载体转...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭志栋，邵佳佳，马红伟，
申请(专利权)人：山东多美康生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：