一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体提供了一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，纯化方法包括亲和层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析。本发明专利技术中阳离子交换层析的平衡条件与阴离子交换层析的流穿条件一致，阴离子交换层析收集的样品，无需处理可直接进入阳离子交换层析，中间无需进行样品处理或溶液置换，大大的节约了纯化时间，提高了纯化效率，同时本发明专利技术提供的抗TSLP单克隆抗体与TSLP抗原具有较高的结合能力，能够有效抑制TSLP抗原与其受体复合物的结合，进而阻止由TSLP靶向的免疫细胞释放促炎性细胞因子，所以本发明专利技术筛选得到的抗TSLP单克隆抗体能够有效用于治疗免疫性疾病或癌症。隆抗体能够有效用于治疗免疫性疾病或癌症。隆抗体能够有效用于治疗免疫性疾病或癌症。

【技术实现步骤摘要】
一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别涉及一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法。

技术介绍

[0002]哮喘是一种由多种炎症细胞与介质参与的气道慢性炎症性疾病，这种慢性炎症与气道高反应性相关，临床表现为反复发作的喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状。在全球范围内，大约有3亿人患有哮喘。大量研究证明约三分之二的严重哮喘表现为Th2类细胞因子过表达，TSLP是引起Th2类细胞因子过表达的重要因子。
[0003]胸腺基质淋巴细胞生成素TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)是一种针对促炎性刺激(例如肺内过敏原、病毒及其他病原体)产生的上皮细胞因子，具有增强胸腺细胞增生的作用。TSLP驱动下游T2细胞因子的释放，包括IL
‑
4、IL
‑
5和IL
‑
13，导致炎症和哮喘症状。TSLP也能激活参与非T2驱动炎症的多种类型细胞。因此，TSLP在炎症级联反应的早期上游活动已被确定为在广泛哮喘患者群体中的一个潜在靶点，可用于T2炎症驱动(T2高)的哮喘及非T2炎症驱动型哮喘。此外，TSLP通过激活未成熟DC、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞来调节免疫。TSLP通过与其特异性受体TSLPR和共同受体IL
‑
7Rα形成复合物来启动细胞内信号传导。TSLP首先与TSLPR高亲和力结合，然后与IL
‑
7Rα的胞外结构域形成三元复合物。TSLP的两个相对面分别与TSLPR和IL
‑
7Rα相互作用。STAT5的激活是TSLP介导的Th2反应所必需的信号。抗TSLP的人源化单克隆抗体能够特异性地结合人TSLP并阻断其与受体复合物的相互作用，由此可能阻止由TSLP靶向的免疫细胞释放促炎性细胞因子，从而防止哮喘发作并改善哮喘控制。
[0004]目前，阿斯利康及其合作伙伴安进公司的Tezepelumab(又名AMG157)是首个靶向TSLP的单克隆抗体药物，但目前仍未上市。鉴于TSLP靶点药物在哮喘治疗上的重要性，为了满足国内外哮喘患者的需求，本专利技术涉及的抗TSLP人源化单克隆抗体，与Tezepelumab单抗具有相似的结合表位，这将预示着尽可能降低生产成本才能提高单克隆产品的竞争力。随着抗TSLP人源化单克隆抗体生产规模的扩大和上游发酵工艺蛋白表达量的增加，下游纯化工艺面临更高的挑战。因此，不断寻求针对抗TSLP人源化单克隆抗体的纯化工艺的创新策略，以及筛选更有效的纯化介质将越来越受到关注，提高抗TSLP人源化单克隆抗体下游纯化质量和效率取决于从细胞培养、料液收获、纯化和最终精制等一系列各种参数的筛选。目前，常规的抗体药物制备工艺一般包括三步层析法，但每一步层析结束后均需通过换液或调整缓冲液来适应下一步的纯化条件，在批量生产中，过多的中间操作步骤不仅造成时间的浪费，还会影响回收率、增加成本，而且可能面临新杂质引入的风险。同时，进口层析介质的市场垄断性的存在无形中增加了生产成本，为此，常规方法对于本专利技术提供的抗TSLP单克隆抗体并不适用。因此，急需开发一种能够专门适用于本专利技术提供的抗TSLP单克隆抗体的纯化方法。

技术实现思路

[0005]为了满足国内外市场需求，本专利技术通过对免疫文库的筛选，得到了可以与TSLP特异性结合且具有较高生物学活性的抗TSLP单克隆抗体或其抗原结合片段，同时本专利技术根据该单克隆抗体的特性，通过大量的实验最终提供了一种适用于本专利技术提供的抗TSLP单克隆抗体的纯化方法。
[0006]本专利技术具体技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
[0008]S1、亲和层析：
[0009]S11、平衡：用缓冲液B1对亲和层析柱进行平衡；
[0010]S12、上样：将含有抗TSLP单克隆抗体的细胞上清液上样至所述亲和层析柱上，上样载量按50
‑
70mg/ml；
[0011]S13、淋洗：上样结束后，使用所述缓冲液B1进行第一次淋洗，待紫外信号平稳后，使用缓冲液B2进行第二次淋洗，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗；
[0012]S14、洗脱：淋洗结束后，使用缓冲液B3对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时开始收集蛋白溶液，当所述紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的所述蛋白溶液备用；
[0013]S2、阴离子交换层析：
[0014]S21、平衡：用缓冲液B4对阴离子层析柱进行平衡；
[0015]S22、上样：将步骤S1中收集的所述蛋白溶液上样至所述阴离子层析柱上；
[0016]S23、收集：上样结束后，再次使用所述缓冲液B4进行再平衡，当所述紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当所述紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的所述蛋白溶液备用；
[0017]S3、阳离子交换层析：
[0018]S31、平衡：用所述缓冲液B4对阳离子层析柱进行平衡；
[0019]S32、上样：将步骤S2中收集的所述蛋白溶液上样至所述阳离子层析柱；
[0020]S33、再平衡：上样结束后，再次使用所述缓冲液B4进行再平衡，待所述紫外吸收值平稳后，停止冲洗；
[0021]S34、洗脱：使用缓冲液B5对所述阳离子层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当所述紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，即得到纯化后的抗TSLP单克隆抗体的蛋白溶液。
[0022]本专利技术提供了一种专门针对抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，通过大量实验筛选了三步纯化法所需的条件和层析介质，有效提高抗TSLP单克隆抗体的纯化效率和回收率，同时本专利技术中步骤S3中阳离子交换层析的平衡条件与步骤S2中阴离子交换层析的流穿条件一致，所以阴离子交换层析收集的样品，无需处理可直接进入阳离子交换层析，中间无需进行样品处理或溶液置换，不仅大大的节约了纯化时间，而且避免了纯化过程中引入杂质，提高了纯化蛋白的纯度，具有较高的实用性。
[0023]进一步的，步骤S1中，所述抗TSLP单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，所述轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，所述抗TSLP单克隆抗体选自
以下任意一种：
[0024]A
‑Ⅰ
：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：S1、亲和层析：S11、平衡：用缓冲液B1对亲和层析柱进行平衡；S12、上样：将含有抗TSLP单克隆抗体的细胞上清液上样至所述亲和层析柱上，上样载量按50
‑
70mg/ml；S13、淋洗：上样结束后，使用所述缓冲液B1进行第一次淋洗，待紫外信号平稳后，使用缓冲液B2进行第二次淋洗，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗；S14、洗脱：淋洗结束后，使用缓冲液B3对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时开始收集蛋白溶液，当所述紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的所述蛋白溶液备用；S2、阴离子交换层析：S21、平衡：用缓冲液B4对阴离子层析柱进行平衡；S22、上样：将步骤S1中收集的所述蛋白溶液上样至所述阴离子层析柱上；S23、收集：上样结束后，再次使用所述缓冲液B4进行再平衡，当所述紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当所述紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的所述蛋白溶液备用；S3、阳离子交换层析：S31、平衡：用所述缓冲液B4对阳离子层析柱进行平衡；S32、上样：将步骤S2中收集的所述蛋白溶液上样至所述阳离子层析柱；S33、再平衡：上样结束后，再次使用所述缓冲液B4进行再平衡，待所述紫外吸收值平稳后，停止冲洗；S34、洗脱：使用缓冲液B5对所述阳离子层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当所述紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，即得到纯化后的抗TSLP单克隆抗体的蛋白溶液。2.如权利要求1所述的抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述抗TSLP单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，所述轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，所述抗TSLP单克隆抗体选自以下任意一种：A
‑Ⅰ
：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；A
‑Ⅱ
：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:9所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；A
‑Ⅲ
：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互
补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:13所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:14所示的氨基酸序列；A
‑Ⅳ
：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:15所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:16所示的氨基酸序列。3.如权利要求2所述的抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗TSLP单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子选自以下任意一种：MA
‑Ⅰ
：所述重链可变区包含如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列；MA
‑Ⅱ
：所述重链可变区包含如SEQ ID No:19所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:20所示的氨基酸序列；MA
‑Ⅲ
：所述重链可变区包含如SEQ ID No:21所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:22所示的氨基酸序列；MA
‑Ⅳ
：所述重链可变区包含如SEQ ID No:23所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:24所示的氨基酸序列；优选的，所述鼠源抗体分子为MA
‑Ⅰ
。4.如权利要求3所述的抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述鼠源抗体分子还包括选自鼠的IgG1型、IgG2...

【专利技术属性】
技术研发人员：白义，李春菊，刘晓航，
申请(专利权)人：北京东方百泰生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：