一种基于邻位连接调控的电化学发光免疫分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于邻位连接调控的电化学发光免疫分析方法，包括步骤：S1.DNA1通过金硫键自组装固定在金电极表面，得到电化学发光传感器；S2.将制备好的电化学发光传感器浸入包含目标蛋白的检测溶液，进行孵育；S3.孵育完成后，以电化学发光传感器作为工作电极，浸入包含三丙胺的PBS缓冲溶液中，采用电化学发光仪记录其电化学发光强度，测定目标蛋白的含量；本发明专利技术通过抗体识别、生物素和链霉亲和素的亲和作用将多条DNA2与抗体偶联，形成目标蛋白、抗体和一对多条DNA2的偶联物，由于邻位效应，偶联物上的多条DNA2与DNA1杂交，邻菲罗啉钌嵌入DNA双链，增强电化学发光信号。本方法仅需一对DNA单链，无需标记；无需将DNA单链和抗体提前偶联，普适性强；灵敏度高。灵敏度高。灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于邻位连接调控的电化学发光免疫分析方法


[0001]本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种基于邻位连接调控的电化学发光免疫分析方法。

技术介绍

[0002]近些年来，癌症已成为世界上严重影响身体健康、威胁患者生命的主要疾病之一。因此对于重大疾病的早期诊断非常必要。而重大疾病的早期诊断往往依赖于检测生物标志物的分析方法。蛋白质作为一类重要的生物标志物在临床疾病诊断中起着非常重要的作用。临床上测定蛋白质的方法有放射免疫法、酶联免疫吸附法和电化学发光免疫法等。其中电化学发光免疫法因其信号物质无放射污染、存放时间长和检测方法灵敏度高、背景低的优势在蛋白质的临床检测中正逐步替代放射免疫法和酶联免疫吸附法。传统的电化学发光免疫分析往往需要多步识别，步骤繁琐，分析时间长。
[0003]基于邻位连接的分析方法是一种高灵敏度和高特异性的体外分析方法，具有灵敏度高、选择性好、简单快速、一步识别等优点在临床检测中显示出巨大的潜力。该方法是通过一对标记有一段寡核苷酸(单链DNA)的单克隆或者多克隆抗体的探针作为邻位探针，对目标物进行识别，实现对目标物的检测。目前邻位连接分析的识别元素主要分为适体和抗体两种，一方面，适体作为一段核苷酸链，其与目标蛋白的结合不具有普适性，不是所有的目标蛋白都有对应的适体，针对特定蛋白的适体，需要大量实验反复筛选，才可以得到与其结合的适体，因此限制了该方法的应用。另一方面，尽管以抗体为识别元素的邻位连接分析方法已取得了一定的进展，但是需要提前将DNA和抗体进行偶联。
[0004]申请号为2018106949047的中国专利技术专利，公开了一种均相化学发光法检测犬IL
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6的定量试剂盒及其使用方法，需要提前根据不同DNA序列结合相应的基团和不同偶联剂与抗体结合，来制备不同抗体的偶联物，如分别使用偶联剂琥珀酰亚胺
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环已烷
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碳酸酯和偶联剂SMCC制备得到的偶联物：DNA1
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IL
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6抗体1偶联物、DNA2
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IL
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6抗体2偶联物；在其DNA和抗体偶联物的制备过程中，一个抗体偶联一个DNA链，引入一个信号分子，极大地限制了方法的灵敏度，并且需要设计多对DNA单链，并需要在一DNA单链进行标记，并引入内切酶，设计较为复杂。因此，亟需开发一种不需要与目标蛋白结合的特定适体，也不需要设计复杂的多对DNA序列并需要将其和抗体提前偶联或进行标记，且具有更高灵敏度的邻位连接的分析方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种基于邻位连接调控的电化学发光免疫分析方法，该方法相比现有技术不需要与目标蛋白结合的特定适体，无需设计多对DNA单链，无需将其和抗体提前偶联或进行标记，且具有更高灵敏度的邻位连接的分析方法。
[0006]本专利技术为了实现上述目的，采用以下技术方案：
[0007]一种基于邻位连接调控的电化学发光免疫分析方法，包括如下步骤：
[0008]S1.DNA1通过金硫键自组装固定在金电极表面，得到电化学发光传感器；
[0009]S2.将制备好的电化学发光传感器浸入待检测溶液中，进行孵育；
[0010]S3.孵育完成后，以电化学发光传感器作为工作电极，浸入包含三丙胺的PBS缓冲溶液中，采用电化学发光仪记录其电化学发光强度，根据电化学发光强度与已知目标蛋白含量建立的标准曲线，测定待检测溶液中目标蛋白的含量；
[0011]所述检测溶液包含链霉亲和素
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生物素化的DNA2、生物素化抗体1、生物素化抗体2和邻菲罗啉钌；
[0012]所述DNA1和DNA2为DNA单链，所述DNA1一端修饰巯基，另一端与DNA2的一端含有互补的碱基；所述DNA2另一端修饰有生物素；
[0013]所述生物素化抗体1和生物素化抗体2为目标蛋白的不同抗体标记了生物素，且生物素化抗体1和生物素化抗体2可与目标蛋白形成特异性的夹心免疫反应。
[0014]本专利技术将由DNA1与金电极通过金硫键自组装形成的电化学发光传感器浸入含链霉亲和素
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生物素化的DNA2、生物素化抗体1、生物素化抗体2和邻菲罗啉钌组成的待检测溶液中；当目标蛋白存在时，生物素化抗体1、生物素化抗体2与目标蛋白发生特异性夹心免疫反应，同时生物素化抗体1和生物素化抗体2上的生物素与链霉亲和素
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生物素化的DNA2上的链霉亲和素发生亲和反应，由于邻位效应，使得多条DNA2靠近DNA1，两条DNA互补杂交形成DNA双链结构，同时邻菲罗啉钌嵌入DNA双链，使得电化学发光信号的增强。
[0015]进一步地，所述DNA1和DNA2为一端含有8
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13个互补碱基的DNA单链。
[0016]优选地，所述DNA1和DNA2为一端含有12个互补碱基的DNA单链。
[0017]优选地，所述DNA1序列如SEQ ID NO:1所示，DNA2序列如SEQ ID NO:2所示。
[0018]所述链霉亲和素
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生物素化的DNA2其结构为DNA2单链一端修饰生物素，DNA2单链修饰生物素后，再通过生物素结合链霉亲和素。
[0019]进一步地，所述链霉亲和素
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生物素化的DNA2中链霉亲和素、生物素化DNA单链的物质的量比为1：3。
[0020]当链霉亲和素、生物素化DNA单链反应的物质的量比为1：3时，理论上1分子的链霉亲和素能与4分子的生物素发生亲和反应，因此可以使得链霉亲和素
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生物素化的DNA2中1分子链霉亲通过生物素与多条DNA2单链连接，从而使链霉亲和素
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生物素化的DNA2含有多条可以DNA1发生杂交的DNA单链，从而可以进一步提高电化学信号强度，另外，链霉亲和素
‑
生物素化的DNA2还可以与另外一个生物素发生亲和反应，用来结合生物素抗体1或生物素抗体2，从而发生邻位连接。
[0021]进一步地，所述检测溶液包含0.3
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0.7μmol/L的链霉亲和素
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生物素化的DNA2、0.1
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0.3μmol/L的生物素化抗体1、0.1
‑
0.3μmol/L的生物素化抗体2和25
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75μmol/L的邻菲罗啉钌。
[0022]进一步地，所述检测溶液的溶剂为PBS缓冲液，其缓冲液浓度为75
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150mmol/L。
[0023]优选地，PBS缓冲液的pH为7.4。
[0024]进一步地，所述电化学发光传感器的制备方法为：将金电极浸入物质的量浓度为5
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20μmol/L的捕获探针DNA1溶液中，孵育1
‑
5h，使其通过金硫键自组装于金电极表面，然后再浸入物质的量浓度为0.5
‑
2mmol/L巯基乙醇中，封闭20
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于邻位连接调控的电化学发光免疫分析方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.DNA1通过金硫键自组装固定在金电极表面，得到电化学发光传感器；S2.将制备好的电化学发光传感器浸入待测溶液中，进行孵育；S3.孵育完成后，以电化学发光传感器作为工作电极，浸入包含三丙胺的PBS缓冲溶液中，采用电化学发光仪记录其电化学发光强度，根据电化学发光强度与已知目标蛋白含量建立的标准曲线，测定待测溶液中目标蛋白的含量；所述检测溶液包含链霉亲和素
‑
生物素化的DNA2、生物素化抗体1、生物素化抗体2和邻菲罗啉钌；所述DNA1和DNA2为DNA单链，所述DNA1一端修饰巯基，另一端与DNA2的一端含有互补的碱基；所述DNA2另一端修饰有生物素；所述生物素化抗体1和生物素化抗体2为目标蛋白的不同抗体分别标记了生物素，且生物素化抗体1和生物素化抗体2可与目标蛋白形成特异性的夹心免疫反应。2.根据权利要求1所述的电化学发光免疫分析方法，其特征在于，所述DNA1和DNA2为一端含有8
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13个互补碱基的DNA单链。3.根据权利要求1所述的电化学发光免疫分析方法，其特征在于，所述DNA1序列如SEQ ID NO:1所示，DNA2序列如SEQ ID NO:2所示。4.根据权利要求1所述的电化学发光免疫分析方法，其特征在于，所述链霉亲和素
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生物素化的DNA2其结构为DNA2单链一端修饰生物素，DNA2单链修饰生物素后，再通过生物素结合链霉亲和素。5.根据权利要求1所述的电化学发光免疫分析方法，其特征在于，所述链霉亲和素
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生物素化的DNA2中链霉亲和素、生物素化DNA单链反应的物质的量比为1：3。6.根据权利要求1所述的电化学发光免疫分析方法，其特征在于，所述检测溶液包含0.3
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0.7μmol/L的链霉亲和素
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生物素化的DNA2、0.1
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【专利技术属性】
技术研发人员：高红方，范叶丽，李海玉，孙雄，王霞，
申请(专利权)人：无锡学院，
类型：发明
国别省市：