一种免疫组化单项染色方法技术

本发明专利技术公开了一种免疫组化单项染色方法，涉及免疫组化技术领域，包括如下步骤：(1)乳腺癌石蜡标本切片后进行抗原修复；(2)切片室温阻断后进行血清封闭；(3)切片血清封闭后进行COL11A1单抗孵育；(4)室温孵育酶标聚合物二抗后显色；(5)显色后进行封片处理完成染色。本申请选用COL11A1作为靶抗原，使得免疫组化单项标记染色法可以有效分辨乳腺癌微小浸润灶。COL11A1在标记乳腺导管原位癌细胞时显示强阳性，在浸润灶中显示弱阳，在乳腺癌旁组织表达更弱，可以明显区分原位和浸润灶，可用于早期浸润性乳腺癌的筛查。浸润性乳腺癌的筛查。浸润性乳腺癌的筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫组化单项染色方法


[0001]本专利技术涉及免疫组化染色方法领域，特别涉及一种免疫组化单项染色方法。

技术介绍

[0002]随着乳腺癌筛查的普及，乳腺导管原位癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)和导管原位癌伴微浸润(ductal carcinoma in situ with microinvasion，DCIS
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MI)的检出率越来越高。DCIS
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MI通常被认为是DCIS发展为侵袭性疾病的过渡阶段，且已有研究表明DCIS
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MI的预后比DCIS更差。形态学上，DCIS是以有完整的外围肌上皮细胞层的存在为特点，而DCIS
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MI是以外围肌上皮细胞层的缺失为诊断依据，外围肌上皮细胞层缺失处即为微小浸润灶。然而外围肌上皮细胞层本身特别小，难以观察缺失，因而从形态学上难以区分DCIS和DCIS
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MI。
[0003]在HE染色或免疫组化单项标记法制备的切片上很难辨别微小浸润灶，导致难以区分DCIS和DCIS
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MI。而在采用免疫组化双染法制备的乳腺组织切片样本中可以有效分辨微小浸润灶。免疫组化双染法是基于同一组织不同部位的抗原表达差异性，将两种抗体分别结合于同一切片组织的不同部位，再利用抗体结合不同的免疫酶系统，使得表达不同抗原的组织显示不同的颜色，通过形态学观察即可区分DCIS和DCIS
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MI。但双染法中人工操作步骤多，人为干扰因素也较多，为了保证染色清晰且对比度高，必须保证两种颜色的深浅度要恰到好处，而对颜色深浅度的掌控主要取决于操作者的技术水平，对操作者的技术水平要求较高，大幅提高了人工操作难度，且双染快红显色后易溶于有机溶剂，必须采取水溶性封片剂，而水溶性封片剂封片容易产生气泡，不易观察。
[0004]CK7抗体和p63抗体作为乳腺及肌上皮常用的具有较高特异性和敏感度的抗体，常成对用于免疫组化双染法以制备切片样本。CK7是常用乳腺上皮细胞标记抗原，p63是乳腺肌上皮细胞标记抗原。双染法免疫组化切片中，导管原位癌的红色腺上皮周围有间断或连续的棕褐色肌上皮细胞围绕，浸润性区域红色腺上皮周围无棕褐色肌上皮细胞围绕。CK7/p63双染有助于乳腺浸润性癌和非浸润性癌的诊断与鉴别诊断，以及乳腺微小浸润癌的检测。
[0005]但是，p63标记乳腺导管肌上皮细胞核虽然没有背景，但细胞与细胞之间有胞质，会导致假阴性，影响观察者对肌上皮细胞层完整性的判断。而且细针穿刺等操作，可能人为的将DCIS细胞移位至周围间质或脂肪组织中，造成浸润假象。
[0006]COL11A1位于染色体1p21.1上，该染色体编码XI型胶原蛋白三条α链中的一条，并在骨骼发育和纤维形成的过程中发挥作用[Nallanthighal S,HeisermanJP,CheonDJ(2021):Collagen Type XI Alpha 1(COL11A1):ANovel Biomarker andaKeyPlayer in Cancer.Cancers 13]。COL11A1的过表达与肿瘤转移、治疗抵抗以及多种癌症的不良预后相关，且COL11A1也被证明在乳腺癌中表达异常上调[Luo Q,LiJ,SuX,Tan Q,ZhouF,Xie S(2022):COL11A1 serves as abiomarker forpoorprognosis and correlates with immune infiltration inbreastcancer.Frontiers in genetics 13,935860]。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题：针对免疫组化单项标记染色法无法辨别乳腺癌微小浸润灶的问题，选用COL11A1作为靶抗原，使得免疫组化单项标记染色法可以有效分辨乳腺癌微小浸润灶。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供以下的技术方案：
[0009]一种免疫组化单项染色方法，包括如下步骤：
[0010](1)乳腺癌石蜡标本切片后进行抗原修复；
[0011](2)切片室温阻断后进行血清封闭；
[0012](3)切片血清封闭后进行COL11A1单抗孵育；
[0013](4)室温孵育酶标聚合物二抗后显色；
[0014](5)显色后进行封片处理完成染色。
[0015]优选地，所述乳腺癌石蜡标本切片方法为：将乳腺癌石蜡标本切片3μm，65℃烤箱烤片30min后常规脱蜡至水。
[0016]优选地，所述抗原修复的方法为pH6.0的柠檬酸抗原修复液高压热修复12min。
[0017]优选地，所述阻断的时间为5min。
[0018]优选地，所述血清封闭的具体方法为：使用山羊血清封闭15min。
[0019]优选地，所述COL11A1单抗孵育的方法为：直接向封闭切片的山羊血清中滴加COL11A1单抗，4℃孵育12～16h，孵育后PBS清洗切片。
[0020]优选地，所述COL11A1单抗在山羊血清中的稀释比例1:100。
[0021]优选地，室温孵育酶标聚合物二抗的时间为30min，酶标聚合物二抗孵育后PBS冲洗。
[0022]优选地，所述显色后进行封片处理的具体方法为：酶标聚合物二抗孵育后进行DAB显色，复染，分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
[0023]本专利技术获得的有益效果：
[0024]本申请发现COL11A1在标记乳腺导管原位癌细胞时显示强阳性，在浸润灶中显示弱阳，在乳腺癌旁组织表达更弱，可以明显区分原位和浸润灶，可用于早期浸润性乳腺癌的筛查。
[0025]COL11A1在乳腺原位癌中高表达，在浸润性癌中低表达，有助于乳腺浸润性癌和非浸润性癌的诊断与鉴别诊断，以及乳腺微小浸润癌的检测。本申请利用乳腺肿瘤组织中COL11A1蛋白的表达特性，将其应用于免疫组化单项标记染色法中，有效克服了免疫组化单项标记染色法无法分辨乳腺癌微小浸润灶的问题，充分发挥了单项标记染色的便利性和稳定性，仅需要标记一次COL11A1抗原即可达到双染法的分辨效果，避免了双染法中存在的步骤多、干扰因素多、操作复杂、不易观察、假阴性等问题。
附图说明
[0026]图1不同染色方法制备的组织切片对不同乳腺癌的图像呈现结果。
[0027]图2为STAT3作为乳腺癌单标在不同乳腺癌类型呈现的免疫组化染色结果。
具体实施方式
[0028]下面通过对实施例的描述，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本专利技术的专利技术构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
[0029]收集病理科10例乳腺癌组织样本，应用免疫组化检测COL11A1单项标记或CK7/P63双染法，检测乳腺癌组织中的微小浸润灶。
[0030]实施例1：COL11A1免疫组化单项标记染色法，具体步骤如下：
[0031本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫组化单项染色方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)乳腺癌石蜡标本切片后进行抗原修复；(2)切片室温阻断后进行血清封闭；(3)切片血清封闭后进行COL11A1单抗孵育；(4)室温孵育酶标聚合物二抗后显色；(5)显色后进行封片处理完成染色。2.根据权利要求1中所述的一种免疫组化单项染色方法，其特征在于：所述乳腺癌石蜡标本切片方法为：将乳腺癌石蜡标本切片3μm，65℃烤箱烤片30min后常规脱蜡至水。3.根据权利要求1中所述的一种免疫组化单项染色方法，其特征在于：所述抗原修复的方法为pH6.0的柠檬酸抗原修复液高压热修复12min。4.根据权利要求1中所述的一种免疫组化单项染色方法，其特征在于：所述阻断的时间为5min。5.根据权利要求1中所述的一种免疫组化单项染色方法，其特征在于：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪琛，季盼，陈刚，张炜明，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：