一种基于生物传感器的基因序列检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于生物传感器的基因序列检测方法。基于新型PEI

【技术实现步骤摘要】
一种基于生物传感器的基因序列检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种基于生物传感器的基因序列检测方法。

技术介绍

[0002]真菌的侵染及真菌毒素的滋生，对作物生产、饲料质量等都有很大的影响。据报道，由于霉变、真菌毒素污染，全球每年都会造成几十亿美元的损失。近年来，人们的生活水平不断提高，无公害食品的推广，以及如何加强粮食和产品中的真菌毒素的检测，已成为人们关注的焦点。
[0003]目前已有多种检测真菌毒素的方法，如：生物鉴定、化学分析、仪器分析、免疫分析等。电化学传感器具有高灵敏度、高选择性、低成本、操作简单等优点，而且有些传感器具有微型、便携、自动化等优点。Li等人在玻碳电极上制备了二氧化硅凝胶
‑
离子液体生物相容性膜，研制了一种阻抗生物传感器，其RSD值为1.2％，RSD值为1.2％，AFB1值为0.1～10μg/L，LOD值为0.01μg/L(Li Zaijun et al.A sensitive and highly stable electrochemical impedance immunosensor based on the formation of silica gel
‑
ionic liquid biocompatible film on the glassy carbon electrode for the determination of aflatoxin B 1in bee pollen[J].Talanta，2009，80(5)：1632
‑
1637.)。
[0004]其中，电化学发光(ECL)技术因其操作简单、仪器成本低、灵敏度高、背景噪声低而被广泛采用。为进一步改善ECL生物传感器的性能，可以在ECL体系中引入二维(2D)纳米材料。将MXenes(二维过渡金属碳化物)应用于生物传感器是一种很好的方法，因为MXenes可以很方便地对信号分子和纳米粒子进行修饰。基于MXene的纳米材料将是扩展研究领域并提高ECL生物传感器更先进性能的强大工具。Ti3C2是MXenes的一种，它的金属导电率高达6500Scm
‑1，是一种非常有潜力的电极材料。基于MXene的纳米材料将是扩展研究领域并提高ECL生物传感器更先进性能的强大工具。Zhang等报道了通过具有增强ECL信号的MXene纳米片检测外源物(Zhang，H.；Wang，Z.；Zhang，Q.；Wang，F.；Liu，Y.Ti3C2MXenes Nanosheets Catalyzed Highly Efficient Electrogenerated Chemiluminescence Biosensor for the Detection of Exosomes.Biosens.Bioelectron.2019，124
‑
125，184
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190.)。
[0005]DNA四面体是按照简单的退火技术组装而成的(Ye，J.et.al，Dual
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Wavelength ratiometric electrochemiluminescence immunosensor for cardiac troponin detection.Analytical Chemistry 2019，91(2)，1524
‑
1531.)。DNA四面体作为DT探针已经被用作电化学和电化学发光生物传感器构成的电极表面的支架。一般情况下，硫醇化的单、双链DNA探针都不含二级结构，可以轻易地与金电极相结合。但是，由于其密度和垂直度难以控制，使得DNA探针在电极上的分布不均匀，从而导致了DNA分子间的杂交，从而使识别单元和目标的杂交效率大大下降。但近来的研究显示，DT可以克服上述缺陷，并将其应用于电极中。比如，Chen等建立了一种电化学生物传感器，利用DT纳米结构以检测DNA的甲基化
(Chen，X.，et.al，A pH
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engineering regenerative DNA tetrahedron ECL biosensor for the assay of SARS
‑
CoV
‑
2 RdRp gene based on CRISPR/Cas12a trans
‑
activity，ACS Appl.Mater.Interfaces.2019，11(4)，3745
‑
3752.)。
[0006]二茂铁(Fc)对Ru(bpy)
32+
的ECL的信号转换归因于电子转移机制，其中Fc参与了Ru(bpy)32+的氧化还原以获得
″
信号关闭
″
的ECL。与Fc上的电荷有关的静电因素影响了淬灭途径，其中Ru(bpy)
32+
的激发态可以通过ET机制被带有中性或负电荷的Fc淬灭。目前，Ru(bpy)
32+
发光被Fc钝化的途径一般是通过电子转移(ET)、能量转移(EnT)或两者发生。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对现有技术中检测植物真菌时存在的问题，提供了一种基因序列检测方法。
[0008]本研究构建的ECL生物传感器使用DT探针作为骨架，在其上进行无酶的熵驱动链置换反应对靶标进行等温扩增，并利用二茂铁(Fc)对Ru(bpy)
32+
的ECL信号淬灭特性，构建了生物传感器，图1解释了这种生物传感器的具体原理。
[0009]在玻碳电极表明附上构建的PEI
‑
Ru(dcbpy)
32+
@Ti3C2@AuNPs纳米复合材料并修饰ECL生物传感器，用DT探针取代传统的线性单链DNA或发夹DNA，可以增强生物传感器的稳定性，减少非特异性吸附，从而形成一个优秀的抗干扰传感平台。在远离电极的DT顶点延伸出一条DNA单链L，与DNA1和DNA2杂交后，形成三链底物复合物，然后进行进一步的熵驱动反应。在有靶标的情况下，靶标会与单链L上未结合的toehold1区域杂交，形成中间体，此时DNA2和L之间的结合很弱，无法保持吸附，因此DNA2被自发释放出来。暴露出新的toehold2区域会与燃料链F结合，并将DNA1和靶标置换下来，靶标继续参与之后的链置换反应。燃料链F上带有二茂铁(Fc)，被吸附在电极表面，从而淬灭Ru(bpy)32+的ECL信号。
[0010]ECL强度与靶标的浓度有关，基于该生物传感器，可以实现特定靶标序列的定量检测，比如，真菌中特定靶标序列的定量检测。与传统的PCR扩增相比，熵驱动反应不需要酶，可以通过简单的一步操作，实现目标的循环扩增，是一种简便快速的扩增方法。
[0011]一种基于生物传感器的基因序列检测方法，使用ECL电化学生物传感器进行检测，所述ECL电化学生物传感器包括表面修饰有PEI
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Ru(dcbpy)<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于生物传感器的基因序列检测方法，其特征在于，使用ECL电化学生物传感器进行检测，所述ECL电化学生物传感器包括表面修饰有PEI
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Ru(dcbpy)
32+
@Ti3C2@AuNPs纳米复合材料的电极，所述电极上还偶联有DT探针，所述DT探针为由T1、T2、T3、T4四条单链DNA退火组装形成的DNA四面体结构，所述基因序列检测方法包括以下步骤：(1)将T1、DNA1和DNA2三条DNA链制备成三链DNA复合物，；(2)将ECL电化学生物传感器与三链DNA复合物进行孵育；(3)将步骤(2)孵育后的ECL电化学生物传感器浸入加入有燃料链F的待检测溶液中反应，反应完成后检测ECL信号强度，ECL信号强度越低，待检测溶液中靶标序列浓度越高，其中，T1序列包括依次排列的以下部分：用于和靶标序列结合的T1
‑
1、用于和部分DNA2结合的T1
‑
2、用于和部分DNA1结合的T1
‑
3，以及用于构建DNA四面体支架的T1
‑
4，用于和燃料链F结合的T1
‑
5，T1
‑
1和T1
‑
2具有部分序列的重叠，以使靶标序列与T1
‑
1结合时，DNA2与T1
‑
2的结合力变弱而掉落，T1
‑
5的序列为T1
‑
2序列和T1
‑
3序列；T2序列、T3序列、T4序列用于构建DNA四面体支架；所述DNA四面体结构中的DNA四面体支架由T1序列中的T1
‑
4、T2序列、T3序列以及T4序列组装而成，T1序列的T1
‑
1、T1
‑
2和T1
‑
3从DNA四面体支架中远离电极的顶点伸出；T2序列、T3序列和T4序列的一端各修饰有用于与电极偶联的偶联基团；所述燃料链F上连接有二茂铁。2.根据权利要求1所述基于生物传感器的基因序列检测方法，其特征在于，PEI
‑
Ru(dcbpy)
32+
@Ti3C2@AuNPs纳米复合材料的制备方法包括以下步骤：(a)将Ru(dcbpy)3
2+
溶于缓冲液中，并加入EDC/NHS混合溶液，获得混合液1；(b)将Ti3C2溶液与PEI溶液混合，获得混合液2；(c)将混合液2加入混合液1中，Ru(dcbpy)3
2+
和PEI通过酰胺键结合；(d)向步骤(c)所得反应液中加入HAuCl4和NaBH4溶液，通过NaBH4将HAuCl4还原为Au NPs，获得所述PEI
‑
Ru(dcbpy)
32+
@Ti3C2@AuNPs纳米复合材料。3.根据权利要求1所述基于生物传感器的基因序列检测方法，其特征在于，电极偶联DT探针时，DT探针的浓度为0.4～1.2μM；步骤(3)中ECL电化学生物传感器浸入加入有燃料链F的待检测溶液中反应时，孵育时间不少于25min，燃料链F浓度为1.2～1.8μM。4.根据权利要求3所述基于生物传感器的基因序列检测方法，其特征在于，电极偶联DT探针时，DT探针的浓度为0.8～1.0μM；步骤(3)中ECL电化学生物传感器浸入加入有燃料链F的待检测溶液中反应时，孵育时间不少于35min，燃料链F浓度为1.5～1.8μM。5.根据权利要求4所述基于生物传感器的基因序列检测方法，其特征在于，电极偶联DT探针时，DT探针的浓度为1.0μM；步骤(3)中ECL电化学生物传感器浸入加入有燃料链F的待检测溶液中反应时，孵育时间为35min，燃料链F浓度为1.5μM。
6.根据权利要求1所述基于生物传感器的基因序列检测方法，其特征在于，待检测溶液中的靶标序列为锐顶镰孢菌(F.acuminatum)的特异性片段，序列为TTGGTTTTACATCCCGGATAGAGCATC。7.根据权利要求6所述基于生物传感器的基因序列检测方法，其特征在于，待检测对象中靶标序列浓度为10aM～10pM；检测下限为2.85fM。8.根据权利要求6所述基于生物传感器的基因序列检测方法，其特征在于，DT探针中T1、T2、T3、T4的序列分别为：T 1：...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘荣辉，朱霞，张凯，沈星星，胡晋，关亚静，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：