一种核糖体蛋白S11及制备方法和在疫苗佐剂中的应用技术

本发明专利技术公开了一种核糖体蛋白S11及制备方法和在疫苗佐剂中的应用，提供了一种新的核糖体蛋白S11，是一种粪肠球菌产生的诱导先天免疫记忆活性物质核糖体蛋白；与灭活的白色念珠菌相比，其显示出较强的诱导天然免疫记忆作用；该核糖体蛋白具有良好的稳定性，低细胞毒性和溶血活性，为实际应用奠定理论基础，确定了核糖体蛋白作为疫苗佐剂的作用，为未来开发为新型佐剂、同时具备先天免疫记忆和适应性免疫的双记忆疫苗奠定坚实的基础。疫的双记忆疫苗奠定坚实的基础。疫的双记忆疫苗奠定坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种核糖体蛋白S11及制备方法和在疫苗佐剂中的应用


[0001]本专利技术公开一种诱导天然免疫记忆的核糖体蛋白及其制备方法，同时还提供其作为疫苗佐剂的用途，属于生物医药


技术介绍

[0002]疫苗是预防和控制疾病感染的有效措施。疫苗佐剂是指加入疫苗中能够非特异地增强疫苗抗原免疫原性的物质，可以促进、延长或增强疫苗抗原特异性免疫应答。在疫苗中使用佐剂能够提高弱免疫原性抗原的免疫效果；改善现有疫苗的免疫效果；减少抗原用量从而降低抗原产能压力或提高疫苗的产量；降低疫苗的价格。疫苗佐剂的生物学作用包括如下几个方面：使抗原缓慢释放、延长抗原在体内停留时间；扩大抗原的表面积，增强吞噬细胞的吞噬和抗原提呈；增强抗原的免疫原性，使无免疫原性或仅有微弱免疫原性的物质变成有效的免疫原；引起或增强迟发型超敏反应，促进局部的炎症反应；增强机体对抗原刺激的反应性，可以提高初次应答和再次应答所产生抗体的滴度；改变抗体类型，使由产生IgM转变为产生IgG。
[0003]近些年，随着DNA重组技术的快速发展，重组亚单位疫苗、合成肽疫苗和核酸疫苗等新型疫苗的研发取得了快速的发展。但是与传统疫苗相比，这些疫苗抗原的相对分子重量较小，通常免疫原性较弱，所以需要佐剂增强其作用。铝佐剂和油水乳剂的使用由来已久，此外微生物也是佐剂的重要来源，如卡介苗、病毒样颗粒、CPG
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DNA、MPLA等。微生物及其代谢产物具有易获取、成本低，易刺激机体的免疫反应等优点，微生物佐剂在疫苗佐剂中均发挥着不可忽视的作用。
[0004]尽管已有多种佐剂被许可使用，然而这些现有的佐剂仍存在诸多问题或不足，体现在：佐剂活性仍然较弱；诱生Th2类免疫应答和体液免疫，不能诱生Th1类和CTL细胞免疫应答，在应对胞内感染或肿瘤等时乏力；存在抗原特异性，通用性不强；毒性大，导致注射部位的溃疡、肉芽肿和疼痛及以及更频繁的全身症状等毒副作用。现有佐剂类别难以达到或满足实际疫苗生产的需求，新型疫苗佐剂的研发仍十分必要。近来一些SARS
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CoV
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2疫苗在保护效力和时长方面体现的不足，不仅促使人们积极开发更新换代疫苗，也突出了对新型佐剂的急迫需求。免疫学理论和技术最新发展，对新型佐剂的开发具有重要的指导意义。本专利技术从粪肠球菌的次级代谢产物中分离纯化出诱导天然免疫记忆的活性物质核糖体蛋白S11，佐剂活性分析其具有优良的疫苗佐剂活性，能作为疫苗佐剂开发应用，并为研制能同时诱导天然免疫记忆和适应性免疫记忆的双记忆疫苗提供了原材料。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供一种诱导天然免疫记忆的核糖体蛋白S11，是一种粪肠球菌产生的诱导先天免疫记忆活性物质核糖体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因如SEQ ID NO.2所示。
[0006]本专利技术的目的之二在于提供一种诱导天然免疫记忆的核糖体蛋白S11的纯化制备
方法，包括如下步骤：（1）发酵上清制备：将保存于
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80℃的粪肠球菌于TSB平皿划线，37℃恒温培养至出现单菌落，然后挑取单菌落至5 mL TSB液体培养基中，37℃、180 rpm振荡培养3 h，然后以1%（v/v）比例转接至10 L TSB液体培养基中，37℃、180 rpm振荡培养6 h，10000g、4℃下离心10 min，0.22μm滤器过滤得发酵上清；（2）粗蛋白捕获：将发酵上清以80%饱和度硫酸铵溶液在4℃沉淀16 h，然后12000g、4℃下离心20 min，收集沉淀，使用蒸馏水复溶，然后用1000 Da的透析袋透析除去硫酸铵，直至硫酸铵被完全去除，采用1%氯化钡检测硫酸铵是否除干净，最后通过真空冷冻干燥获得粗蛋白，保存于
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80℃；（3）纯化：将粗蛋白应用离子交换层析和制备型HPLC进行纯化。将粗蛋白通过Q
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Tanrose 6FF阴离子交换层析柱，采用阶梯固定梯度洗脱方式，以0 M NaCl
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1.0 M NaCl固定时间程序进行洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，流速为1mL/min，以280nm为检测波长，收集各洗脱峰，利用小鼠腹腔巨噬细胞天然免疫记忆模型，确定诱导天然免疫记忆的目标活性峰。进一步将目标峰利用Ultimate XB
‑
C18液相色谱柱经HPLC进行纯化，流动相A为蒸馏水；B为乙腈，线性梯度洗脱，洗脱程序为：0
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5min，20%乙腈洗脱；5
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25 min，20%
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100%乙腈洗脱；25
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30 min，100%乙腈洗脱。多次重复进样后，将检测具有诱导天然免疫记忆的活性峰合并，冷冻干燥获得核糖体蛋白S11。
[0007]本专利技术的目的之三在于提供一种诱导天然免疫记忆的核糖体蛋白S11的重组表达方法，包括如下步骤：（1）构建表达载体：设计引物，扩增核糖体蛋白S11基因，经酶切和连接，并且通过转化构建表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）；（2）诱导表达：得到的重组表达菌株在37℃，180 rpm振荡培养至OD
600
=0.6
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0.8时，再加入异丙基
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β
‑
D
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硫代半乳糖苷至终浓度为500 μmol/L，16℃，160 rpm诱导24 h。
[0008]（3）纯化：得到的发酵液在8000g、4℃离心10 min，收集菌体。超声破碎菌体后的上清10000g、4℃离心20 min，应用镍柱进行亲和层析纯化，分别用20 mM、100 mM咪唑洗脱杂蛋白，收集500 mM咪唑洗脱部分，应用超滤除去咪唑、甘油等杂质，然后进行真空冷冻干燥纯化得到重组表达核糖体蛋白。
[0009]本专利技术的目的之四在于提供核糖体蛋白S11的佐剂效应应用分析。该方法包括如下步骤：为研究核糖体蛋白S11对模式抗原卵清白蛋白（OVA）免疫小鼠的佐剂作用，本研究将50只雌性C57/BL6小鼠随机分为空白对照组（Saline）、单独免疫OVA组（OVA）、OVA+铝佐剂组（OVA+Alum）、OVA+核糖体蛋白组低、高（4mg/kg、20 mg/kg）剂量组。在实验的第1 d和第15 d进行免疫，共免疫两次，在第29 d、36 d、43 d、50 d时时，利用ELISA法检测血清中OVA特异性抗体IgG水平。结果显示，与铝佐剂相比，OVA+核糖体蛋白S11组具有显著增强体液免疫应答效果，诱导更强烈的抗体反应，产生更高水平的特异性IgG，维持了更长时间的血清抗体水平；与OVA组相比，OVA+核糖体蛋白S11免疫后小鼠脾组织体积明显增大，脾组织重量增加明显；组织病理学染色结果表示OVA+核糖体蛋白S11免疫后小鼠脾组织的生发中心的大小和数量显著增加。CCK8法检测OVA+核糖体蛋白S11免疫后脾淋巴细胞增殖能力显著增强，表明核糖体蛋白S11可以诱导细胞免疫反应；以上结果表明核糖体蛋白S11具有成为新型佐剂
的巨大潜力。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核糖体蛋白S11，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因如SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的一种核糖体蛋白S11的纯化制备方法，包括如下步骤：（1）发酵上清制备：将保存于
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80℃的粪肠球菌于TSB平皿划线，37℃恒温培养至出现单菌落，然后挑取单菌落至5 mL TSB液体培养基中，37℃、180 rpm振荡培养3 h，然后以1%（v/v）比例转接至10 L TSB液体培养基中，37℃、180 rpm振荡培养6 h，10000g、4℃下离心10 min，0.22μm滤器过滤得发酵上清；（2）粗蛋白捕获：将发酵上清以80%饱和度硫酸铵溶液在4℃沉淀16 h，然后12000g、4℃下离心20 min，收集沉淀，使用蒸馏水复溶，然后用1000 Da的透析袋透析除去硫酸铵，直至硫酸铵被完全去除，采用1%氯化钡检测硫酸铵是否除干净，最后通过真空冷冻干燥获得粗蛋白，保存于
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80℃；（3）纯化：将粗蛋白应用离子交换层析和制备型HPLC进行纯化；将粗蛋白通过Q
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Tanrose 6FF阴离子交换层析柱，采用阶梯固定梯度洗脱方式，以0 M NaCl
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1.0 M NaCl固定时间程序进行洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，流速为1mL/min，以280nm为检测波长，收集各洗脱峰，利用小鼠腹腔巨噬细胞天然免疫记忆模型，确定诱导天然免疫记忆的目标活性峰；将目标峰利用Ultimate XB
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C18液相色谱柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨勇军，张建刚，彭自然，陈巍，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：