多重幽门螺杆菌单碱基突变体的电化学分阶段检测方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，涉及多重幽门螺杆菌单碱基突变体的电化学分阶段检测方法。方法中采用的电化学传感器包括传感电极、辅助DNA、sgRNA和Cas9核酸酶；传感电极由导电基体、金纳米颗粒、探针DNA和纳米CdS，探针DNA的两端分别连接金纳米颗粒和纳米CdS，导电基体与金纳米颗粒连接；探针DNA、所述辅助DNA与目标DNA能相互杂交形成Y型结构；所述sgRNA和所述Cas9核酸酶能够形成Cas9/sgRNA复合物，Cas9/sgRNA复合物能够破坏Y型结构，使纳米CdS从Y型结构上分离。本发明专利技术通过对核酸总量和单碱基突变体的检测，实现对幽门螺杆菌感染状况和耐药状况的全面评估。和耐药状况的全面评估。和耐药状况的全面评估。

【技术实现步骤摘要】
多重幽门螺杆菌单碱基突变体的电化学分阶段检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，涉及多重幽门螺杆菌单碱基突变体的电化学分阶段检测方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]幽门螺杆菌(H.pylori)是一种革兰氏阴性杆菌，其感染与许多消化系统疾病密切相关。当前，H.pylori感染防治面临着感染率上升和单核苷酸突变体(SNV)引起的耐药率上涨的难题。在H.pylori临床诊断中常用的检测技术包括胃镜检查、13C/14C尿素呼吸法、血清法、粪便检查和尿检。目前，针对SNV的检测技术主要有：用于SNV检测的熔融曲线分析、使用增强杂交探针的SNV检测和蛋白质辅助的SNV检测。但至今尚无一种方法能在同时分析核酸总量与检测单一基因型。因此，进一步研究一种高通量、高选择性检测幽门螺杆菌DNA和单碱基突变体的新方法显得尤为重要。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术的不足及实际需求，本专利技术的目的是提供多重幽门螺杆菌单碱基突变体的电化学检测方法，通过对核酸总量和单碱基突变体的检测，实现对幽门螺杆菌感染状况和耐药状况的全面评估。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0006]一方面，一种电化学传感器，包括传感电极、辅助DNA、sgRNA和Cas9核酸酶；
[0007]所述传感电极由导电基体、金纳米颗粒、探针DNA和纳米CdS，所述探针DNA为发夹结构，且所述探针DNA的两端分别连接金纳米颗粒和纳米CdS，导电基体与金纳米颗粒连接；
[0008]所述探针DNA、所述辅助DNA与目标DNA能相互杂交形成Y型结构；
[0009]所述sgRNA和所述Cas9核酸酶能够形成Cas9/sgRNA复合物，所述Cas9/sgRNA复合物能够破坏Y型结构，使纳米CdS从Y型结构上分离。
[0010]另一方面，一种多重幽门螺杆菌单碱基突变体的电化学检测方法，提供上述电化学传感器；包括如下步骤：
[0011]将辅助DNA和待测目标DNA加入至传感电极进行孵育，检测ECL信号；
[0012]将sgRNA和Cas9核酸酶进行预孵育获得Cas9/sgRNA复合物；
[0013]将获得的Cas9/sgRNA复合物添加至孵育后的传感电极上，继续进行孵育，检测ECL信号；
[0014]通过ECL信号差异实现对待测目标DNA的检测；
[0015]所述目标DNA为幽门螺杆菌单碱基突变体。
[0016]第三方面，一种幽门螺杆菌单碱基突变体的电化学检测试剂盒，包括上述电化学
传感器、缓冲液。
[0017]由于探针DNA为发夹结构，金纳米颗粒与纳米CdS靠近产生共振能量传递效应，所以此时没有ECL信号。当目标DNA存在时，能够与辅助DNA、探针DNA相互杂交形成Y型结构，这种空间构象的变化打破了共振能量传递效应，产生了ECL信号。信号强度与核酸浓度呈正相关，由于长链反应中单个碱基错配结合的效率降低有限，在第一阶段，突变体和非突变体都可以形成Y形结构产生信号，通过这种低特异性模式可以完成对幽门螺杆菌总核酸的检测。在第二阶段，使用具有高序列特异性的cas9内切酶来检测突变体。sgRNA与Cas9结合形成Cas9/sgRNA复合物，切除特定基因型的核酸，破坏Y形结构，通过信号差异法检测不同的单碱基突变体。所有的突变体表型都是由特定的基因型检测出来的。
[0018]本专利技术的有益效果为：
[0019]1.本专利技术首先完成对幽门螺杆菌核酸总量的检测，目标序列通过形成Y型DNA结构打破发卡探针的共振能量转移效应，产生电致化学发光(ECL)信号，信号强度与核酸浓度呈正相关。第二阶段通过Cas9的高特异性识别切割作用，利用相应的引导RNA切除特定基因型的核酸，以信号差值法检测不同的单碱基突变体。通过两个特异性不同的阶段的检测对幽门螺杆菌感染状况和耐药状况进行全面评估。
[0020]2.本专利技术可以以氧化铟锡(ITO)导电玻璃为基底，在芯片上集成电极阵列，可以提高检测的通量。每个电极单元均可以完成对样品的分析，透明的玻璃基底有利于进行可视化检测，实现核酸的可视化检测。
附图说明
[0021]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0022]图1为本专利技术实施例的检测原理示意图。
[0023]图2为本专利技术实施例的高倍透射电镜图。a为本专利技术实施例所制的AuNPs的透射电镜照片；b为本专利技术实施例所制的CdS的透射电镜照片；c为本专利技术实施例所制的CdS结合AuNPs的高倍透射电镜照片。
[0024]图3为本专利技术实施例的凝胶电泳表征图。a为本专利技术实施例验证Y型结构形成的凝胶电泳图；图3b为本专利技术实施例验证CRISPR/Cas9酶切Y型结构的凝胶电泳图。
[0025]图4为本专利技术实施例的条件优化结果图，a为不同Na
+
浓度与ECL信号变化曲线，b为同Mg
2+
浓度与ECL信号变化曲线，c为使用不同缓冲液后ECL信号随时间变化曲线，d为不同Help链浓度与ECL信号强度变化的柱状图。
[0026]图5为不同阶段系列目标DNA浓度与ECL信号的对数线性关系图。本专利技术实施例的灵敏度检测结果。a为第一阶段不同目标DNA浓度对数与ECL信号的校正曲线；图b为第二阶段不同目标DNA浓度对数与ECL信号的校正曲线；
[0027]图6为a为本专利技术实施例不同摩尔比的wtDNA与mutDNA，混合DNA样品对应的第一阶段ECL信号曲线图；b为本专利技术实施例不同摩尔比的wtDNA与mutDNA，混合DNA样品对应的第二阶段ECL信号曲线图。
[0028]图7为本专利技术实施例的特异性检测结果。
[0029]图8为本专利技术制备的高通量ITO阵列电极芯片模板示意图。
具体实施方式
[0030]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0031]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0032]鉴于目前没有能够同时分析核酸总量与检测单一基因型的方法，本专利技术提出了多重幽门螺杆菌单碱基突变体的电化学检测方法。
[0033]本专利技术的一种典型实施方式，提供了一种电化学传感器，包括传感电极、辅助DNA、sgRNA和Cas9核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电化学传感器，其特征是，包括传感电极、辅助DNA、sgRNA和Cas9核酸酶；所述传感电极由导电基体、金纳米颗粒、探针DNA和纳米CdS，所述探针DNA为发夹结构，且所述探针DNA的两端分别连接金纳米颗粒和纳米CdS，导电基体与金纳米颗粒连接；所述探针DNA、所述辅助DNA与目标DNA能相互杂交形成Y型结构；所述sgRNA和所述Cas9核酸酶能够形成Cas9/sgRNA复合物，所述Cas9/sgRNA复合物能够破坏Y型结构，使纳米CdS从Y型结构上分离。2.如权利要求1所述的电化学传感器，其特征是，探针DNA一端修饰有巯基，金纳米颗粒通过Au
‑
S键连接探针DNA。3.如权利要求1所述的电化学传感器，其特征是，探针DNA一端修饰有胺基，纳米CdS通过酰胺键连接探针DNA。4.如权利要求1所述的电化学传感器，其特征是，所述导电基体为玻碳电极或导电玻璃。5.如权利要求1所述的电化学传感器，其特征是，探针DNA如SEQ ID NO.2所示；或，辅助DNA如SEQ ID NO.3所示；或，目标DNA如SEQ ID NO.1、4和/或5所示；或，sgRNA如SEQ ID NO.11、12和/或13所...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡善文，杨欢，黄冠泽，邓媛，叶为民，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：