一种基于液液萃取检测尿液中23种农药代谢物的方法技术

本发明专利技术属于环境化学和生物样本分析领域，涉及农药代谢物测定方法，提供了一种基于液液萃取检测尿液中23种农药代谢物的方法，即一种基于液液萃取联合超高效液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种基于液液萃取检测尿液中23种农药代谢物的方法


[0001]本专利技术属于环境化学和生物样本分析领域，涉及尿中农药代谢物的测定分析方法，具体涉及一种同时测定1mL尿中23种农药(含三类杀虫剂、两类除草剂和一类杀真菌剂)代谢物的方法及其在孕妇尿液中23种农药代谢物定量分析中的应用。

技术介绍

[0002]随着我国农业的快速发展，农药使用种类和量不断增长，所产生的生态环境及公众健康问题不容忽视。人体常同时暴露于多种农药，其中有机磷类杀虫剂(organophosphate insecticides；OPs)、拟除虫菊酯类杀虫剂(pyrethroid insecticides；PYRs)和新烟碱类杀虫剂(neonicotinoid insecticides；NNIs)是我国使用的主要杀虫剂品种，苯氧羧酸类除草剂(chlorophenoxy herbicides；CPHs)和灭草松是我国广泛使用的除草剂，杀真菌剂多菌灵(Carbendazim；CBDZ)是我国使用最广泛的杀真菌剂。这几类农药都具有使用量大、暴露广泛的特点，人体可通过接触食物、水、灰尘等暴露于上述农药对健康产生威胁。它们进入人体代谢后主要通过尿液排出，通过测定尿样中农药代谢物的浓度水平，可准确反映这些人体的内暴露水平。建立一种可同时检测尿液中多种农药代谢物的高效分析方法，有助于全面、快速评估人群暴露多类农药的累积健康风险。
[0003]目前已有一些检测人体尿液中农药代谢物的液相色谱
‑
质谱联用法，但基本局限测定尿液中OPs和PYRs代谢物，无法同时分析人体尿液中多个类别农药代谢物，且已有方法存在样本前处理成本相对高、前处理过程净化度不高、基质效应强、方法检出限高的局限性。此时，构建一种成本相对低、快捷高效、且具有低基质效应及较高准确性和灵敏度的方法至关重要，为人群多种农药的暴露风险评估提供有利手段。

技术实现思路

[0004]本专利技术的任务是提供一种基于液液萃取检测尿液中23种农药代谢物的方法，即一种基于液液萃取检测尿液中23种农药代谢物的UPLC
‑
MS/MS方法，也即一种基于液液萃取联合超高效液相色谱
‑
三重四级杆质谱法(UPLC
‑
MS/MS)同时测定1mL尿液中4种OPs代谢物、3种PYRs代谢物、10种NNIs代谢物、3种CPHs代谢物、1种灭草松代谢物、以及2种CBDZ代谢物的方法，使其具有前处理简单、基质效应低、检测高效快速、特异性和灵敏度高、稳定性和重现性好的特点，可用于评价人体尿液中上述多种农药的内暴露水平，以克服上述现有方法中存在的不足。
[0005]本专利技术中具体检测的尿液中五类23种农药代谢物及其母体农药信息见表1
‑
1。
[0006]表1
‑
1. 23种农药代谢物及其母体农药信息表
[0007][0008]F
–
杀真菌剂
[0009]H
–
除草剂
[0010]N
–
新烟碱类杀虫剂
[0011]O
–
有机磷类杀虫剂
[0012]P
–
拟除虫菊酯类杀虫剂
[0013]实现本专利技术的技术方案是，本专利技术提供的检测方法包括以下步骤：
[0014](1)前处理方法：使用液液萃取的前处理方法。
[0015]1)前处理方法的步骤：
[0016]步骤一、酶解：室温解冻尿样，涡旋混匀。加入水解酶以催化葡萄糖醛酸结合物发生水解反应并生成相应的游离态化合物。
[0017]步骤二、萃取：加入有机溶剂作为萃取剂以提取样本中待测分析物，并重复该萃取步骤以提高待测物的萃取效率。
[0018]步骤三、氮吹：将提取液进行氮吹后，并加入一定量的重悬液进行重悬，获得待测样品，以待下一步上机检测。
[0019]2)前处理的具体方法是：
[0020]步骤一、酶解：室温解冻尿样，涡旋混匀。加入β葡萄糖醛酸苷酶/硫酸酯酶溶液孵育过夜以催化葡萄糖醛酸结合物发生水解反应并生成相应的游离态化合物。
[0021]步骤二、萃取：加入乙酸乙酯/叔丁基甲醚作为萃取剂以提取样本中待测分析物，并重复该萃取步骤以提高待测物的萃取效率。
[0022]步骤三、氮吹：将提取液进行氮吹后，并加入一定量的水：乙腈作为重悬液进行重悬，获得待测样品，以待下一步上机检测。
[0023]3)前处理方法可按以下具体条件进行：
[0024]步骤一、酶解：室温解冻尿样，涡旋混匀。用LC
‑
MS grade水做流程空白。使用校准合格的移液器，取1mL尿样加入15mL聚乙烯离心管中，然后加入100μL(850单位)的β葡萄糖醛酸苷酶/硫酸酯酶溶液和100μg/L的同位素混合内标标准液10μL(含每个同位素内标1ng)。将混合液转入恒温摇床后，37℃孵育过夜16h。次日将混合液取出，混匀后短暂离心。
[0025]步骤二、萃取：向上述15mL聚丙烯离心管中加入3mL乙酸乙酯/叔丁基甲醚(体积比5:1)萃取剂；用多通道涡旋振荡器震荡混匀15min，然后以转速3000g离心10min；用洁净的玻璃巴斯德吸管将上清液转移至洁净的15mL玻璃氮吹管中。向15mL聚丙烯离心管中的剩余残液再加入相同体积的萃取剂重复该萃取步骤以提高待测物的萃取效率。收集两次上清液于上述的15mL玻璃氮吹管中。
[0026]步骤三、氮吹：将两次收集的上清液置于玻璃氮吹仪中，35℃氮吹50min。待玻璃管中的液体吹至近干时，取出玻璃管并加入重悬液水：乙腈(7:3)500μL。涡旋两次后，将液体过滤并转移至棕色进样瓶中，获得待测样本，
‑
20℃保存备用。
[0027](2)色谱分离方法：使用超高效液相色谱进行分离。
[0028]1)在色谱分离过程中，利用超高效液相色谱将待测物与尿液基质分离。
[0029]2)使用HSS T3色谱柱，以甲酸水溶液和乙腈分别为流动相A相和B相；采用梯度洗脱方式对待测物进行分离。
[0030]3)液相色谱的具体条件为：使用2.1mm
×
150mm的ACQUITY HSS T3色谱柱，以0.05％甲酸水溶液和乙腈分别为流动相A相和B相，设置流动相流速为0.30mL/min，进样体积为10μL。色谱柱工作温度设置为40℃；采用梯度洗脱方式对待测物进行分离，流动相梯度洗脱程序设置见表1
‑
2，分析时长14.5min。
[0031]表1
‑
2.流动相梯度洗脱程序
[0032][0033](3)质谱方法：使用三重四级杆质谱进行检测。
[0034]1)在质谱检测过程中，利用三重四级杆质谱进行检测。
[0035]2)采用多离子反应监测(MRM)，同时采用正、负电喷雾电压模式进行待测物检测。
[0036]3)具体质谱分析条件为：离子源温度设置为650℃；喷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于液液萃取同时检测尿中23种农药代谢物的UPLC
‑
MS/MS方法，其特征在于，使用液液萃取对1mL尿液样品进行前处理，采用UPLC
‑
MS/MS检测，其中液相色谱分离采用甲酸水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，质谱分析采用电喷雾多离子反应监测(MRM)正负模式同时扫描，采用质谱同位素内标法进行定量，通过配制待测物标准工作液建立校准曲线，定性定量同时检测23种农药代谢物，包含4种有机磷类杀虫剂代谢物、3种拟除虫菊酯类杀虫剂代谢物、10种新烟碱类杀虫剂代谢物、3种苯氧羧酸类除草剂代谢物、1种灭草松代谢物、以及2种多菌灵代谢物；所述的23种农药代谢物为：2
‑
异丙基
‑6‑
甲基
‑4‑
嘧啶醇，2
‑
[(二甲氧基磷硫酰基)磺酰]琥珀酸，对硝基苯酚，3,5,6
‑
三氯
‑2‑
吡啶酚，3
‑
苯氧基苯甲酸，4
‑
氟
‑3‑
苯氧基
‑
苯甲酸甲酯，反式
‑3‑
(2,2
‑
二氯乙烯基)
‑
2,2
‑
二甲基环丙烷羧酸，啶虫脒，去甲基
‑
啶虫脒，噻虫胺，去甲基
‑
噻虫胺，呋虫胺，吡虫啉，吡虫啉
‑
烯烃，5
‑
羟基
‑
吡虫啉，噻虫嗪，去甲基
‑
噻虫嗪，2,4
‑
二氯苯氧乙酸，2,4,5
‑
三氯苯氧乙酸，2
‑
甲,4
‑
氯苯氧乙酸，灭草松，多菌灵，5
‑
羟基甲苯咪唑；根据离子对和出峰时间对待测物进行定性，利用内标法及根据峰面积对待测物进行定量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对尿液样品前处理方法包括以下步骤：步骤一、酶解：室温解冻尿样，涡旋混匀，加入水解酶以催化葡萄糖醛酸结合物发生水解反应并生成相应的游离态化合物；步骤二、萃取：加入有机溶剂作为萃取剂以提取样本中待测分析物，并重复该萃取步骤以提高待测物的萃取效率；步骤三、氮吹：将提取液进行氮吹后，并加入一定量的重悬液进行重悬，获得待测样品，以待下一步上机检测。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一中所述的加入水解酶以催化葡萄糖醛酸结合物发生水解反应并生成相应的游离态化合物的具体方法是：用LC
‑
MS grade水做流程空白。使用校准合格的移液器，取1mL尿样加入15mL聚乙烯离心管中，然后加入100μL(850单位)的β葡萄糖醛酸苷酶/硫酸酯酶溶液和100μg/L的同位素混合内标标准液10μL(含每个同位素内标1ng)，将混合液转入恒温摇床后，37℃孵育过夜16h，次日上午将混合液取出，混匀后短暂离心。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二中所述的加入有机溶剂作为萃取剂以提取样本中待测分析物，并重复该萃取步骤以提高待测物的萃取效率的具体方法是：向上述15mL聚丙烯离心管中加入3mL乙酸乙酯/叔丁基甲醚(体积比5:1)萃取剂；用多通道涡旋振荡器震荡混匀15min，然后以转速3000g离心10min；用洁净的玻璃巴斯德吸管将上清液转移至洁净的15mL玻璃氮吹管中；向15mL聚丙烯离心管中的剩余残液再加入相同体积的萃取剂重复该萃取步骤以提高待测物的萃取效率；收集两次上清液于上述的15mL玻璃氮吹管中。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三中所述的将提取液进行氮吹后，并加入一定量的重悬液进行重悬，获得待测样品的具体方法是：将两次收集的上清液置于玻璃氮吹仪中，35℃氮吹50min。待玻璃管中的液体吹至近干时，取出玻璃管并加入重悬液水：乙腈(7:3)500μL。涡旋两次后，将液体过滤并转移至棕色进样瓶中，获得待测样本，
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20℃保存备用。
6.根据权利要求1所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏玮，王爱珍，马海呷呷，万延建，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：