一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法技术

本发明专利技术涉及一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法。在该方法中，将活性氧响应基团引入聚合物，利用聚合物装载交联剂，制备位点特异性释放的活性氧响应化学交联剂载体。将活性氧响应化学交联剂载体与细胞共孵育，经过细胞内吞作用，载体到达细胞内特定部位；或将活性氧响应化学交联剂载体静脉注射入活体鼠体内，经血液循环渗透到特定组织或器官。在特定部位微环境中高浓度活性氧的刺激下，载体的聚合物发生响应，进行交联剂的快速、定点释放，原位交联蛋白质复合物。将细胞、组织、器官破碎，进行蛋白质复合物的提取，随后利用i

【技术实现步骤摘要】
一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法


[0001]本专利技术涉及一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法，属于生物分析


技术介绍

[0002]蛋白质组是指在一种细胞、组织或生物体中完整基因组所表达的全套蛋白质。蛋白质组学就是通过研究细胞、组织或生物体中蛋白质组的组成及其变化规律，从而实现对生物学功能的研究，主要研究内容包括：蛋白质丰度、亚细胞定位、周转代谢、相互作用和翻译后修饰等(Nat Rev Mol Cell Bio,2015,16(5),269
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280)。
[0003]研究蛋白质结构的常见方法有X射线晶体、核磁共振波谱和冷冻电镜。但是X射线晶体需要高纯结晶蛋白；核磁共振波谱需要纯蛋白溶在特定溶剂，并且适用于小分子量蛋白；冷冻电镜破坏蛋白质复合物天然构象。研究蛋白质
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蛋白质相互作用的常见方法有亲和纯化质谱、酵母双杂交、免疫共沉淀和邻近标记。亲和纯化质谱和免疫共沉淀都不能捕获瞬时或弱的相互作用，不能区分直接或间接相互作用，而且会导致蛋白质相互作用的重组。酵母双杂交将蛋白与结构域融合，可能改变空间构象。邻近标记在活体和组织中，标记探针递送困难。
[0004]而化学交联质谱不仅能够提供蛋白质
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蛋白质相互作用信息，而且能够补充蛋白质构象信息。它能够捕获瞬时或弱的相互作用，提供相互作用界面信息，而且能够对于天然环境下的大规模蛋白质复合物进行分析。
[0005]当前交联剂发展迅速，出现大量不同臂长、不同反应基团的化学交联剂，但是分别有溶解度差、极易水解、不能捕获特定位点蛋白质复合物等缺点，并且交联剂在活体中由于血液循环里被猝灭和清除，导致无法用于活体的蛋白质复合物原位分析。因此本专利利用载体进行交联剂递送，能够保护交联剂、改善交联剂溶解度、实现靶向交联。
[0006]常规载体有高分子聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒、无机非金属纳米颗粒(介孔二氧化硅、碳纳米管)、金属纳米颗粒(纳米金)等，它们各自具有稳定性好、生物相容性好、高比表面积、易修饰等优点，但是它们作为药物载体的共同点都是缓释。
[0007]重要生物标志物活性氧在肿瘤细胞、炎症细胞、激活免疫细胞中存在高表达。细胞内活性氧产生的主要途径有线粒体呼吸链途径和NADPH氧化酶途径。线粒体呼吸链是细胞内活性氧产生的主要来源，约90％活性氧产生于线粒体，由于肿瘤细胞的异常增殖和线粒体功能障碍，使得其活性氧浓度高达100μM(Asian J Pharm Sci,2018,13(2),101
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112)。NADPH氧化酶是活性氧在一些免疫细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞)中的主要来源，当细胞膜受到刺激(微生物、非颗粒)后，胞质内的NADPH氧化酶复合物的组分向吞噬体膜、核内体膜和质膜上转移，组合成完整的NADPH氧化酶复合物，引发呼吸爆发机制，产生大量ROS，引起免疫反应。
[0008]因此，为了实现载体快速释放交联剂进行蛋白质复合物的原位交联，利用内源性高表达的活性氧设计出活性氧响应载体，它能够在高浓度活性氧刺激下，快速并且位点特
异性释放交联剂进行蛋白质复合物交联。
[0009]在本专利中，针对现有化学交联剂溶解度差、极易水解、无法靶向交联等问题，以及现有载体缓释的问题，利用特定细胞、组织和器官内源性高表达活性氧这一特点，发展出基于活性氧响应化学交联剂载体的蛋白质复合物原位分析方法，以实现高浓度活性氧下蛋白质复合物的原位分析。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的是提供一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法，通过本专利技术的方法实现了特定部位(高浓度活性氧环境)蛋白质复合物的原位分析。
[0011]一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法，具体包括以下步骤：
[0012](1)制备活性氧响应聚合物。将活性氧响应基团嵌入高分子骨架中，活性氧响应基团由硫醚、缩硫酮、单碲基团或者芳香硼酸酯组成；高分子骨架主要为碳链高分子、杂链高分子、元素有机高分子，如聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚已内酯、聚乳酸
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羟基乙酸、聚乳酸、聚乙醇酸、葡聚糖、壳聚糖等。
[0013]从生物相容性和快速活性氧响应两个方面构建活性氧响应聚合物，从聚合物嵌段组成、骨架材料两个方面研究生物相容性优异的载体基质；通过调整聚合物链段上活性氧响应基团密度、响应基团种类、亲水/疏水嵌段比例，从而为快速释放奠定基础。
[0014](2)制备活性氧响应化学交联剂载体。交联剂可为：二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯、双(磺基琥珀酰亚胺)戊二酸、二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、双琥珀酰亚胺亚砜、3,3'
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二硫双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯)、二甲基吡咪酯、乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯、二琥珀酰亚胺二丁基脲、二硫基双马来酰亚胺乙烷、双马来酰亚胺基己烷、1,4
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双马来酰亚胺基丁烷、癸二酸二琥珀酰亚胺酯、N
‑
(β
‑
马来酰亚胺丙氧基)琥珀酰亚胺酯、N
‑
ε
‑
马来酰亚胺基己酰
‑
氧琥珀酰亚胺酯、N
‑
γ
‑
马来酰亚胺基丁酰
‑
氧琥珀酰亚胺酯、二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯、琥珀酰亚胺
‑
6(3
‑
[2
‑
吡啶基二硫代]‑
丙酰氨基)已酸酯、m
‑
马来酰亚胺基苯甲酰
‑
N
‑
羟基琥珀酰亚胺酯、3
‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丙酰肼、N
‑
琥珀酰亚胺基溴乙酸酯、N
‑
琥珀酰亚胺碘乙酸酯、琥珀酰亚胺4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸酯、琥珀酰亚胺4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧基
‑
(6
‑
氨基己酸)、琥珀酰亚胺基4
‑
(p
‑
马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、琥珀酰亚胺6
‑
((β
‑
马来酰亚胺丙酰氨基)己酸)、琥珀酰亚胺3
‑
(2
‑
吡啶基二硫基)
‑
丙酸酯、磺基琥珀酰亚胺6
‑
(3'
‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丙酰氨基)已酸酯、m
‑
马来酰亚胺基苯甲酰
‑
N
‑
羟基磺基琥珀酰亚胺酯、N
‑
磺基琥珀酰亚胺碘代乙酸盐、磺基琥珀酰亚胺6
‑
(4'...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将活性氧响应基团引入聚合物，构建活性氧响应聚合物；(2)利用活性氧响应聚合物装载交联剂，制备位点特异性释放的活性氧响应化学交联剂载体；(3)将活性氧响应化学交联剂载体与细胞共孵育，经过细胞的内吞作用，载体到达细胞内特定部位，在特定部位微环境中活性氧的刺激下，载体的聚合物发生响应，进行交联剂的释放，原位交联蛋白质复合物；或将活性氧响应化学交联剂载体静脉注射入活体鼠体内，经血液循环渗透到特定组织或器官，在特定部位微环境中活性氧的刺激下，载体的聚合物发生响应，进行交联剂的释放，原位交联蛋白质复合物；(4)将细胞、鼠的组织或鼠的器官破碎，提取蛋白质复合物，利用i
‑
FASP(基于离子液体的过滤辅助样品制备方法)进行样品预处理，结合液质联用技术，对蛋白质复合物进行原位分析。2.如权利要求1所述的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：所述的活性氧响应基团包括：硫醚、缩硫酮、单碲基团、芳香硼酸酯中一种或多种结合；所述的聚合物包括：主要为碳链高分子、杂链高分子、元素有机高分子，如聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚已内酯、聚乳酸
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羟基乙酸、聚乳酸、聚乙醇酸、葡聚糖、壳聚糖等中的一种或二种以上；所述的活性氧响应化学交联剂载体的制备方法包括：乳化溶剂蒸发法(单乳法，双乳法)，纳米沉淀法，乳化溶剂扩散法(单乳法，双乳法)中的一种或二种以上；所述的交联剂包括：其两侧基团分别为下述任一反应基团的、含碳链间隔臂的有机物：反应基团为：可与蛋白上氨基反应的琥珀酰亚胺基团、卤代芳烃或亚胺酸酯；或可为与蛋白上巯基反应的马来酰亚胺基团、2
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巯基吡啶、硫代磺酸盐、卤代乙酰基或吡啶基二硫化物；或可与蛋白上羧基反应的碳化二亚胺或异氰酸盐；或可与蛋白上糖链反应的酰肼基团；或可与蛋白质中的氨基酸残基发生反应的非特异反应基团的苯基叠氮基团或双吖丙啶。3.如权利要求2所述的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：所述琥珀酰亚胺基团为磺酸基
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琥珀酰亚胺和羟基
‑
琥珀酰亚胺中的一种或两种以上；所述苯基叠氮基团为硝基苯叠氮基团和卤代苯叠氮基团中的一种或两种以上。4.如权利要求1所述的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：所述细胞包括：肿瘤细胞(敏感株，耐药株)、炎症细胞、激活免疫细胞中的一种或二种以上；所述活体鼠为耐药细胞移植瘤鼠、敏感细胞移植瘤鼠和诱导炎症鼠模型中的一种或二种以上；所述细胞内特定部位包括：肿瘤细胞线粒体，炎症细胞和激活免疫细胞的质膜、吞噬体、溶酶体、核小体中的一种或二种以上；所述特定组织或器官包括：血液循环1
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24h期间的肿瘤组织，以及具有炎症的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏中的一种或二种以上。5.如权利要求1或4所述的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：所述活性氧响应化学交联剂载体与细胞共同孵育包括：载体与细胞在细胞培养基中共孵育1
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12小时，并收
集细胞。6.如权利要求1所述的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：所述细胞、鼠的组织或器官破碎，提取蛋白质复合物过程包括：细胞中加入含蛋白酶抑制剂cocktail的离子液体，超声破碎细胞，10000
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16000g离心5
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30min，取出上清液样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，周雯，陈玉宛，李欣蔚，赵群，高航，张玮杰，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：