一种流感病毒裂解疫苗的制备方法技术

本发明专利技术提供一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括以下步骤：无血清全悬浮扩大培养犬肾细胞MDCK

【技术实现步骤摘要】
一种流感病毒裂解疫苗的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，是使用MDCK细胞基质来制备流感病毒裂解疫苗，再具体地涉及利用生物反应器无血清全悬浮培养MDCK细胞制备流感病毒裂解疫苗的方法。

技术介绍

[0002]流感(influenza)，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，流感病毒不仅引起地区性流行，同时也引起世界性大流行，据世界卫生组织(WHO)统计，全球每年感染流感病毒的人数可以达10亿人次。此外根据流感爆发的规律，每隔几十年还会引发一次全球流感大流行，这种现象严重威胁公共卫生安全，以及对人类生命健康产生巨大伤害。近几年流感病毒仍然处于大流行前的变异活跃期，发生流感流行和大爆发的威胁一直存在。对于流感这种古老的疾病，到目前为止疫苗接种仍是防止流感发生和流行最有效的手段。
[0003]传统的流感疫苗生产采用鸡胚生产工艺，鸡胚生产工艺存在生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染等诸多缺陷，如遇流感大规模爆发，鸡胚的供应也将存在很大问题。鉴于此，WHO从1995年起开始推动用传代细胞生产流感疫苗。采用传代细胞生产疫苗的工艺将不受鸡胚等天然因素的限制，生产周期短，工艺简单，如遇流感暴发会快速反应，短时间内可提供大量疫苗产品。传代细胞可以用转瓶、细胞工厂和生物反应器等多种方式培养，其中，生物反应器自动化程度高，可将细胞生长和病毒增殖控制在最适条件范围内，提高细胞密度和病毒滴度，实现大批次量、小批间差，产品具有更好的稳定性和安全性，节省了劳动力、生产场地和能源消耗，降低生产成本。生物反应器培养细胞有片状载体、微载体和全悬浮等多种方式，细胞培养至数量达到一定规模时向细胞接种病毒进行病毒增殖培养，从而收获病毒培养液制备疫苗。因细胞全悬浮培养工艺的细胞培养规模可以线性放大，并使用无血清培养基等优势而成为疫苗生产的首选工艺。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种使用生物反应器制备流感病毒裂解疫苗的方法，具体是一种利用生物反应器无血清全悬浮培养MDCK细胞制备流感病毒裂解疫苗的方法，尤其是利用本专利技术的方法可以制备多价流感病毒裂解疫苗，比如二价、三价、四价、五价流感病毒裂解疫苗。本专利技术用传代细胞代替鸡胚生产流感疫苗的同时，开发了保护性更广泛的流感疫苗工艺，而且工艺中不使用抗生素、防腐剂，实现流感疫苗的安全、高效及规模化生产(本项目受国家“重大新药创制”科技重大专项《MDCK细胞生物反应器悬浮培养技术平台的建立及四价流感病毒裂解疫苗临床前研究》资助，课题编号：2015ZX09102016，课题承担单位为兰州百灵生物技术有限公司)。
[0005]本申请提供一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0006]S1，无血清全悬浮扩大培养犬肾细胞MDCK
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XF04细胞，所述犬肾细胞MDCK
‑
XF04细
胞的保藏编号为CCTCCNO：C2018192；
[0007]S2，利用MDCK细胞维持培养基稀释步骤S1的犬肾细胞MDCK
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XF04细胞，然后接种流感病毒进行培养增殖，收获流感病毒液；
[0008]S3，将步骤S2的流感病毒液制备成流感病毒的单价原液；
[0009]S4，将步骤S3制备的单价原液按照流感病毒株血凝素最终含量为24
‑
36μg/ml配制成流感病毒裂解疫苗。
[0010]MDCK细胞(Madin
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Daby Canine Kidney Cells,MDCK)由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬肾脏组织分离培育建立，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异的特点，MDCK细胞系被公认为是最适于流感病毒复制的细胞系之一。本专利技术使用的犬肾细胞MDCK
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XF04全悬浮培养型细胞于2018年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018192，以此基础上开发了生物反应器无血清全悬浮培养MDCK细胞制造流感裂解灭活疫苗的工艺。
[0011]作为优选，步骤S1中，使用5L
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6000L生物反应器无血清全悬浮扩大培养犬肾细胞MDCK
‑
XF04细胞。
[0012]作为优选，步骤S1中，全悬浮无血清培养MDCK细胞通过以下培养放大条件制得：常规方法复苏犬肾细胞MDCK悬浮培养型细胞，用无血清培养基在摇瓶中扩大培养后，以0.5～5.0
×
106个/ml的密度接种生物反应器，培养温度为36～37℃、pH值为7.00～7.30、溶氧为20～80％、转速为50～150rpm，培养3～5天，细胞密度达1.0～1.5
×
107个/ml；再以体积比1:5～1:20的比例转至其他生物反应器中放大培养细胞。
[0013]作为优选，步骤S2中，用MDCK细胞维持培养基将细胞密度稀释至2.0～8.0
×
106个/ml，然后将流感病毒按MOI为0.0001～0.01进行接种。
[0014]作为优选，步骤S2中，接种流感病毒后，甲型流感病毒的培养温度32℃～34℃，乙型流感病毒培养温度33℃～35℃；两种病毒培养的pH值为7.10
±
0.20，溶氧为30％～60％，搅拌转速为80～120rpm；和/或
[0015]步骤S2中，待甲型流感病毒培养液红细胞血凝价达(log2HA/25ul)7以上，且细胞活力≤30％时停止培养、收获病毒液；乙型流感病毒培养液红细胞血凝价(log2HA/25ul)8以上，且细胞活力≤30％时停止培养、收获病毒液。
[0016]作为优选，步骤S3中，将步骤S2的流感病毒液依次经离心除细胞碎片、微滤澄清、超滤浓缩、层析纯化、灭活剂灭活、裂解剂裂解、超滤除裂解剂和过滤除菌，制备成流感病毒的单价原液。
[0017]作为优选，所述微滤澄清是将经除细胞碎片的病毒液，用孔径0.45μm+0.2μm的滤膜过滤澄清；和/或
[0018]所述超滤浓缩是将经微滤澄清的病毒液，用300KD膜包超滤浓缩20～50倍。
[0019]作为优选，所述层析纯化是将经超滤浓缩的病毒浓缩液，依次用Capto core 700凝胶过滤层析和Capto Q ImpRes离子交换层析两步进行纯化；
[0020]作为优选，所述用Capto core 700凝胶过滤层析的具体方法为：采用层析介质为Capto Core 700，上样量不超过柱体积的3倍，平衡液和洗脱液均为pH7.2
‑
7.5的0.1M NaCl PB溶液，线性流速为100
‑
200cm/h，在280nm波长监测下洗脱峰为病毒峰；收集范围：当UV
280nm
起峰时开始收集目标病毒液，实时观察UV
280nm
的值，UV
280nm
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1，无血清全悬浮扩大培养犬肾细胞MDCK
‑
XF04细胞，所述犬肾细胞MDCK
‑
XF04细胞的保藏编号为CCTCC NO：C2018192；S2，利用MDCK细胞维持培养基稀释步骤S1的犬肾细胞MDCK
‑
XF04细胞，然后接种流感病毒进行培养增殖，收获流感病毒液；S3，将步骤S2的流感病毒液制备成流感病毒的单价原液；S4，将步骤S3制备的单价原液按照流感病毒株血凝素最终含量为24
‑
36μg/ml配制成流感病毒裂解疫苗。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，使用5L
‑
6000L生物反应器无血清全悬浮扩大培养犬肾细胞MDCK
‑
XF04细胞。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，用MDCK细胞维持培养基将细胞密度稀释至2.0～8.0
×
106个/ml，然后将流感病毒按MOI为0.0001～0.01进行接种。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，接种流感病毒后，甲型流感病毒的培养温度32℃～34℃，乙型流感病毒培养温度33℃～35℃；两种病毒培养的pH值为7.10
±
0.20，溶氧为30％～60％，搅拌转速为80～120rpm；和/或步骤S2中，待甲型流感病毒培养液红细胞血凝价达(log2HA/25ul)7以上，且细胞活力≤30％时停止培养、收获病毒液；乙型流感病毒培养液红细胞血凝价(log2HA/25ul)8以上，且细胞活力≤30％时停止培养、收获病毒液。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S3中，将步骤S2的流感病毒液依次经离心除细胞碎片、微滤澄清、超滤浓缩、层析纯化、灭活剂灭活、裂解剂裂解、超滤除裂解剂和过滤除菌，制备成流感病毒的单价原液。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述微滤澄清是将经除细胞碎片的病毒液，用孔径0.45μm+0.2μm的滤膜过滤澄清；和/或所述超滤浓缩是将经微滤澄清的病毒液，用300KD膜包超滤浓缩20～50倍。7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述层析纯化是将经超滤浓缩的病毒浓缩液，依次用Capto core 700凝胶过滤层析和Capto Q ImpRes离子交换层析两步进行纯化；作为优选，所述用Capto core 700凝胶过滤层析的具体方法为：采用层析介质为Capto Core 700，上样量不超过柱体积的3倍，平衡液和洗脱液均为pH7...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳冬武，徐水林，马桂兰，
申请(专利权)人：兰州百灵生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：