一种广谱沙门氏菌噬菌体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种广谱沙门氏菌噬菌体，所述噬菌体命名为S4P，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC NO:M2021765。本发明专利技术噬菌体能够快速杀灭21种不同血清型的临床致病性沙门氏菌，裂解率超过95％。本发明专利技术还提供了噬菌体S4P的应用，具体可用于制备沙门氏菌抑菌剂、防治畜禽沙门氏菌病的饲料添加剂、畜禽养殖环境消毒剂。禽养殖环境消毒剂。禽养殖环境消毒剂。

【技术实现步骤摘要】
缓冲液中稀释，然后全部转接到10mLTSB液体培养基中，再接入100μL宿主菌悬液，37℃、 150r/min振荡培养4～6h。将混合培养液8000rpm/min离心处理10min，取上清过0.22μm 滤膜过滤除菌，得到噬菌体原液，用SM缓冲液稀释至10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8倍后，分别取 上述100μL噬菌体稀释液与100μL宿主菌悬液加入到5mL半固体培养基中，摇匀，迅速平 铺于TSA固体平板上，待凝固以后置于37℃恒温培养箱培养4～6h，观察结果。重复此步 骤3～5次，直到每次观察到的噬菌斑形态、大小、透亮程度均匀一致时，即得到纯化后的 沙门氏菌噬菌体原液，命名S4P，纯化后的沙门氏菌噬菌体效价为≥10
11
PFU/mL。
[0042](7)噬菌体的保藏：申请人将该纯化的沙门氏菌噬菌体S4P保藏于中国典型培养物保 藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC NO：M2021765，保藏日期为：2021年6月24日， 保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072。
[0043]实施例2沙门氏菌噬菌体S4P的发酵
[0044](1)菌种活化：将1mL EP管里的菌种用接种环挑取，然后在TSA平板上划线，37℃ 培养24h后挑取单个菌落，接种于10mL TSB液体培养基中，37℃、150r/min过夜培养12h 后，再用移液枪吸取100μL菌液转接于10mLTSB液体培养基中，37℃、150r/min培养4h 至对数生长期，作为发酵宿主菌的种子液。
[0045](2)灭菌：在5L发酵罐内配制3L的TSB液体培养基，加入1mL消泡剂，121℃高 压灭菌20min后，冷却至室温，接通发酵溶氧电极和PH电极，开启搅拌和并通入无菌空气。
[0046](3)接种：MOI＝0.01，将10mL对数生长期的宿主菌接种于3LTSB培养基中，同时 立即接种入100μL噬菌体种子，使用火焰接种环在发酵罐内接种，继续发酵10h。
[0047](4)取样：接入噬菌体种子后在取样口每隔2h取样1mL，8000r/min离心5min后测 定噬菌体效价。
[0048](5)噬菌体效价测定半固体培养基配制：TSB液体培养基中加入0.6％的琼脂，加热 溶解后每试管5mL分装，121℃高压灭菌20min后备用。
[0049](6)噬菌体效价测定：噬菌体发酵液取样离心处理后，取上清100μL，加入900μL SM 缓冲液中，依次逐级稀释至10
‑7～10
‑8梯度。在半固体培养基温度降至55℃左右时，加入 100μL的新鲜宿主菌液和100μL稀释后的噬菌体发酵液，摇晃均匀后倾倒入TSA平板上平 铺均匀，冷却凝固后在37℃培养6～8h观察噬菌斑并统计结果，每个梯度做两个平行。
[0050](7)发酵过程工艺参数：温度为37℃；发酵初始转速为200rpm，通气量为4.0L/min， 此时溶氧维持在95％以上；发酵时间4h后，溶氧开始下降，发酵时间约5h时，溶氧降低 至30％左右，此时打开溶氧控制，通过调节通气量与转速，使溶氧值维持在30％以上，直 至发酵结束。
[0051](8)发酵结果：沙门氏菌噬菌体S4P的发酵液中噬菌体效价达10
11
PFU/mL。
[0052]实施例3沙门氏菌噬菌体S4P的效价检测和形态学特性
[0053](1)噬菌体的保存：将实施例1中纯化后的沙门氏菌噬菌体原液，加入70％的甘油， 按1:1比例混合均匀，用1.5mL的无菌EP管保存于
‑
80℃即可。
[0054](2)噬菌体效价测定方法：噬菌体效价又称噬菌体滴度、噬菌斑形成单位数 (plaque
‑
forming unit，pfu)指的是每毫升试样中侵染性噬菌体的粒子数。双层平板法是测定 噬菌体效价的最普遍使用的方法。
[0055]用无菌的SM缓冲液对沙门氏菌噬菌体原液进行倍比稀释，然后取适当稀释度的噬
菌 体稀释液100μL与对数期的菌液100μL加入到5mL 50℃的TSB半固体培养基中，用漩 涡振荡器充分混匀后，倒入底层平板之上，待培养基充分冷凝之后，将其倒置于恒温培养 箱中培养至出现清晰的噬菌斑为止(约12h)，培养温度设为37℃。
[0056]每个稀释度设置三组平行，取平均值。噬菌体效价计算公式如下：
[0057]噬菌体效价(PFU/mL)＝噬菌斑数
×
稀释倍数
×
10
[0058](3)噬菌体的形态学特性
[0059]噬菌体电镜查看：沙门氏菌噬菌体自命名为S4P，其电镜照片如图2所示，该噬菌体呈 现多面体的头部和较长的尾部，属于有尾目、肌尾科噬菌体。
[0060]实施例4沙门氏菌噬菌体S4P的一步生长曲线
[0061]以实施例1分离纯化的S4P沙门氏菌噬菌体为基础，将感染复数(MOI)为0.01的噬 菌体S4P和宿主菌新鲜菌液各取10mL，混合均匀后开始计时，迅速置于37℃摇床中150r/min 振荡培养，每隔10min取样1mL，8000r/min离心1min，吸取100μL的上清用SM缓冲液 10倍倍比稀释后用双层琼脂平板法测定噬菌体效价，以感染时间为横坐标，噬菌体效价为 纵坐标，绘制一步生长曲线，得到沙门氏菌噬菌体S4P的潜伏期、爆发期，结果如附图3 所示。
[0062]实施例5沙门氏菌噬菌体S4P的热稳定性试验
[0063]取1mL实施例1中沙门氏菌噬菌体S4P纯化后的原液装于无菌EP管中，分别在40℃、 50℃、60℃、70℃水浴中作用5min、10min、20min、30min、45min、60min。作用时间结 束后取出EP管，立即冰浴，用SM缓冲液稀释后按双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
[0064]结果如表1所示，与空白对照组相比，沙门氏菌噬菌体S4P在50℃条件下水浴1h后仍 然有108PFU/mL的噬菌体存活，在60℃水浴20min后仍有106PFU/mL的噬菌体存活。结 果表明，沙门氏菌噬菌体S4P的高温条件下仍具有良好的耐受性。
[0065]表1沙门氏菌噬菌体S4P的热稳定性试验效价结果
[0066][0067]实施例6一种广谱沙门氏菌噬菌体制剂的制备
[0068]取实施例1获得的鸡沙门氏菌噬菌体S4P，采用双层琼脂平板法检测其效价，应≥10
11 PFU/mL，加入等体积的SM缓冲液，即获得一种广谱沙门氏菌噬菌体制剂，其噬菌体效价 ≥10
10
PFU/mL。
[0069]实施例7广谱沙门氏菌噬菌体制剂的杀菌效果试验
[0070]选择不同血清型的沙门氏菌菌株测定实施例6中广谱沙门氏菌噬菌体制剂的杀菌效果， 试验用菌株均由本公司微生物实验室保存，主要从各地养殖场的病死鸡上分离获得，具体 步骤如下：
沙门氏菌CVCC
‑
1797(来自于中国兽医药品监察所，属于强本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种广谱沙门氏菌噬菌体，其特征在于，所述沙门氏菌噬菌体命名为S4P，其保藏号为：CCTCC M 2021765。2.根据权利要求1所述的广谱沙门氏菌噬菌体在制备沙门氏菌抑菌剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠道沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌。4.根据权利要求1所述的广谱沙门氏菌噬菌体在制备净化畜禽养殖环境中沙门氏菌的消毒剂中的应用。5.根据权利要求1所述的广谱沙门氏菌噬菌体在制备防治畜禽沙门氏菌病的饲料添加剂中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述畜禽沙门氏菌病包括鸡白痢、禽伤寒、肠炎、猪副伤寒。7.一种如权利要求1所述的广谱沙门氏菌噬菌体的制剂，其特征在于，制剂中含有所述沙门氏菌噬菌体和辅...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华山，葛冰，张辉，张玉宇，吴立婷，刘爱玲，包红朵，尹相吉，李守军，乔博鑫，王栋，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司高科分公司，
类型：发明
国别省市：