一种柯萨奇病毒B组1型毒株及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种柯萨奇病毒B组1型毒株，毒株命名为KM7

【技术实现步骤摘要】
一种柯萨奇病毒B组1型毒株及应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，更具体地说是涉及一种柯萨奇病毒B组1型毒株及应用。

技术介绍

[0002]柯萨奇病毒B组1型(coxsackievirus B1，CVB1)属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒属，是B组柯萨奇病毒(CVB)的一个主要成员。CVB1感染会引起各种不同程度的疾病或症状，如手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)、脑炎、心肌炎、无菌性脑膜炎甚至死亡。此外，CVB1引起了显著的发病率，在美国疾病控制和预防中心(CDC)报告的前15种肠道病毒血清型中一直排名靠前(CDC2010)。此外，CVB1还与1型糖尿病(T1DM)的发展有关。虽然CVB1已经构成了相当大的公共卫生威胁，但目前还没有批准的疫苗或抗病毒疗法，因此有必要采取不同的策略加快研发预防性疫苗。
[0003]目前肠道病毒疫苗仅有针对脊髓灰质炎病毒和手足口病中肠道病毒71型的灭活疫苗，尚无针对CVB的上市疫苗。国外的研究人员报道了几项CVB疫苗的生产和临床前试验：小鼠接种灭活的CVB1疫苗2～3周即产生了强烈的抗CVB1中和抗体反应；CVB1感染可以加速NOD和SOCS
‑1‑
Tg小鼠的糖尿病发病，并且CVB1疫苗不仅可以防止CVB感染，而且可以防止CVB1诱导的SOCS
‑1‑
Tg小鼠糖尿病的发展。此外，其他形式的CVB1疫苗，如重组亚单位疫苗、DNA疫苗和减毒活疫苗，在小鼠模型中也有不同程度的保护效果。
[0004]灭活疫苗没有减毒活疫苗毒力返祖及可引发疫苗相关疾病的缺点，具有较好免疫原性和安全性。尽管国外已经开发CVB1灭活疫苗，但是其流行株与国内流行株的基因型不一致，其对中国流行株保护效率低，故仍有必要继续开发安全有效的适合中国的CVB1灭活疫苗。
[0005]因此，如何提供一种新的CVB1毒株，并将其应用于制备灭活疫苗中是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种柯萨奇病毒B组1型毒株，可应用于制备柯萨奇病毒B组1型灭活疫苗。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种柯萨奇病毒B组1型毒株，所述毒株命名为KM7
‑
X29，于2022年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202213，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
[0009]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护权所述的柯萨奇病毒B组1型毒株在制备柯萨奇病毒B组1型灭活疫苗中的应用。
[0010]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种柯萨奇病毒B组1型灭活疫苗，包括KM7
‑
X29毒株的抗原和铝佐剂。
[0011]优选的，铝含量浓度为0.35mg/ml。
[0012]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种柯萨奇病毒B组1型灭活疫苗的制备方法，其特征在于，以毒株KM7
‑
X29制备灭活疫苗。
[0013]作为上述技术方案优选的技术方案，制备疫苗具体过程包括下述步骤：
[0014](1)37℃、5％CO2静止培养Vero细胞，直至细胞长成单层，将柯萨奇病毒B组1型毒株KM7
‑
X29以感染复数为0.001～0.1接种到所述细胞培养液中，35℃、5％CO2下培养3
‑
4天直至细胞病变达到90％以上；
[0015](2)收获病变细胞的培养液，获得病毒收获液澄清过滤后，灭活，超滤浓缩获得病毒浓缩液；
[0016](3)对所述病毒浓缩液经密度梯度离心制得病毒纯化液；
[0017](4)向所述病毒纯化液中加入稀释剂和铝佐剂配制得柯萨奇病毒B组1型灭活疫苗；
[0018]优选的，柯萨奇病毒B组1型病毒收获液的制备方法为：柯萨奇病毒B组1型病毒接种Vero细胞，接种MOI为：0.001～0.1，培养液为病毒维持液，培养条件为35
±
1℃、5％CO2，收获时间为2～4天；
[0019]优选的，灭活病毒收获液的灭活方法为甲醛灭活，其中，甲醛灭活时间为：37
±
1℃条件下，灭活7天；
[0020]优选的，病毒液超滤浓缩是通过以下方法实现的：
[0021]病毒灭活液经切向流膜过滤，浓缩倍数为50
‑
200倍，使用截留分子量为100万，优选超滤浓缩采用孔径为100kD的超滤膜包。
[0022]密度梯度离心为：制得的病毒浓缩液先用20％蔗糖垫离心，重悬沉淀，将重悬病毒液经蔗糖梯度(浓度范围：从底层开始2.5ml 60％蔗糖；2.5ml 45％蔗糖；2.5ml 30％蔗糖；2.5ml 15％蔗糖)，40000rpm 4℃离心6h，PBS悬浮所得样品。
[0023]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护所述的柯萨奇病毒B组1型毒株在制备核酸标准品的应用。
[0024]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护所述的柯萨奇病毒B组1型毒株在制备柯萨奇病毒B组1型抗血清产品中的应用。
[0025]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种柯萨奇病毒B组1型病毒抗血清的制备方法，过程为：对动物注射所述柯萨奇病毒B组1型毒株，收集血清，经过Protein G Sepharose High Performance柱纯化后得到所述抗血清，具体过程为：
[0026](1)首次免疫取KM7
‑
X29毒株与弗氏完全佐剂混合乳化，免疫新西兰大耳兔，100μg/只，皮下多点注射；
[0027](2)间隔14天后进行第二次免疫：取KM7
‑
X29毒株与弗氏不完全佐剂混合乳化，100μg/只，皮下多点注射；
[0028](3)间隔14天后进行第三次免疫：取KM7
‑
X29毒株与弗氏不完全佐剂混合乳化，100μg/只，皮下多点注射；
[0029](4)三免后21天采集血液，10000rpm/min离心后取上清，经过100KD超滤膜浓缩后，使用Protein G Sepharose High Performance柱进行纯化，纯化后即为柯萨奇病毒B组1型兔多克隆抗血清，无菌条件下分装，冻存于
‑
80℃备用。采用间接ELISA法和微量中和试验测定抗血清的抗体效价。
[0030]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护所述的柯萨奇病毒B组1型毒株在制备柯萨奇病毒B组1型感染动物模型中的应用。
[0031]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护所述的柯萨奇病毒B组1型毒株在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒B组1型型所致疾病产品中的应用。
[0032]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术方法中繁殖病毒的细胞基质为Ver本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柯萨奇病毒B组1型毒株，其特征在于，所述毒株命名为KM7
‑
X29，于2022年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202213，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。2.权利要求1所述的柯萨奇病毒B组1型毒株在制备柯萨奇病毒B组1型灭活疫苗中的应用。3.一种柯萨奇病毒B组1型毒株灭活疫苗，其特征在于，包括KM7
‑
X29毒株的抗原和铝佐剂。4.一种柯萨奇病毒B组1型毒株灭活疫苗的制备方法，其特征在于，以毒株KM7
‑
X29制备灭活疫苗。5.根据权利要求4所述的一种柯萨奇病毒B组1型毒株灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)37℃、5％CO2静止培养Vero细胞，直至细胞长成单层，将柯萨奇病毒B组1型毒株KM7
‑
X29以感染复数为0.001～0.1接种到所述细胞培养液中，35℃、5％CO2...

【专利技术属性】
技术研发人员：马绍辉，张名，许丹菡，冯昌增，王晓辉，郭伟，刘煜菡，杨昭庆，孙浩，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：