用于病毒纯化的材料和方法技术

本发明专利技术描述了使用染色质

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于病毒纯化的材料和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年6月2日提交的美国序列号63/033,449、2020年6月2日提交的美国序列号63/033,492、2020年6月2日提交的美国序列号63/033,531、2020年6月2日提交的美国序列号63/033,549、2020年6月2日提交的美国序列号63/033,631、2020年6月2日提交的美国序列号63/033,643和2020年6月2日提交的美国序列号63/033,731的优先权的权益，这些申请中的每一篇全文以引用方式并入本文。

技术介绍

[0003]腺相关病毒(AAV)是一种无包膜病毒，其可经工程化以将核酸递送到靶细胞，并且已成为基因治疗和基因递送应用中的有用载体。缺少病毒DNA的重组AAV(rAAV)基本上是基于蛋白质的纳米颗粒，其经工程化以穿过细胞膜，最终可在此将其核酸货物运输和递送到细胞核中。该病毒赋予的特性：当与其他病毒系统相比时，持续的基因表达、因具有广泛组织嗜性而天然存在于人类群体中、非整合性、非致病性、低免疫原性、有丝分裂后细胞的感染性和相对易生产，迎来了人类使用方面的迅速扩张。基于腺相关病毒(AAV)(包括rAAV)的基因递送载体再度显现出对广泛应用是安全且有效的。
[0004]在临床环境中使用AAV(例如，rAAV)凸显了对这样的生产和纯化系统的迫切需求，所述生产和纯化系统能够生成非常大量的纯AAV颗粒并且这些纯AAV颗粒还具有适用于基因治疗的足够病毒滴度。然而，当前技术不能够去除所有杂质，诸如来源于其内生成载体产物的生产系统的组分的残余蛋白质和核酸水平。因此，存在对生产高纯AAV颗粒以及具有高病毒滴度的AAV颗粒的组合物的尚未满足的需求。

技术实现思路

[0005]在一个方面，本文提供了一种用于纯化腺相关病毒(AAV)颗粒的方法，所述方法包括：(a)使包含AAV颗粒的上清液与包含染色质
‑
DNA核酸酶的组合物接触；以及(b)纯化AAV颗粒。
[0006]在一个实施方案中，纯化包括离心、色谱、过滤或它们的组合。在一个实施方案中，离心包括密度梯度离心、超速离心或它们的组合。在一个实施方案中，色谱包括亲和色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱或它们的组合。
[0007]在一个实施方案中，该方法还包括将包含AAV颗粒的上清液与固体支持体一起温育足够的时间量以结合AAV颗粒。
[0008]在一个实施方案中，该方法还包括洗涤固体支持体。在一个实施方案中，该洗涤包括高pH缓冲液。在一个实施方案中，该高pH缓冲液大于pH9.0。在一个实施方案中，该高pH缓冲液在pH 9.0与pH 11之间。在一个实施方案中，该高pH缓冲液为约pH 9.5。在一个实施方案中，该高pH缓冲液为约pH 10.2。在一个实施方案中，该高pH缓冲液为约pH 10.3。在一个实施方案中，该高pH缓冲液为约pH 10.4。
[0009]在一个实施方案中，该方法包括一次或多次亲和色谱纯化。在一个实施方案中，该
亲和色谱包括离子交换色谱。在一个实施方案中，该离子交换色谱包括阴离子交换色谱。
[0010]在一个实施方案中，该上清液是澄清的上清液。
[0011]在一个实施方案中，步骤(a)的组合物还包含
[0012]在一个实施方案中，该温育持续约10分钟至约1小时。在一个实施方案中，该温育持续约20分钟至约40分钟。在一个实施方案中，该温育持续约30分钟。
[0013]在一个实施方案中，该染色质
‑
DNA核酸酶是微球菌核酸酶(MNase)。在一个实施方案中，上清液中的MNase的浓度大于2.5单位/mL。在一个实施方案中，上清液中的MNase的浓度大于10单位/mL。在一个实施方案中，上清液中的MNase的浓度为约30单位/mL至约100单位/mL。在一个实施方案中，上清液中的MNase的浓度为约60单位/mL。在一个实施方案中，将MNase与含有结合的AAV颗粒的固体支持体一起温育。
[0014]在一个实施方案中，使用低pH缓冲液将AAV颗粒从固体支持体洗脱下来。在一个实施方案中，该洗脱还包括低pH缓冲液之前的高pH缓冲液。在一个实施方案中，该低pH缓冲液小于约pH 3.0。在一个实施方案中，该低pH缓冲液为约pH 1.5至约pH 2.5。在一个实施方案中，该低pH缓冲液为约pH 1.5。在一个实施方案中，该低pH缓冲液为约pH 2.5。
[0015]在一个实施方案中，该低pH缓冲液为柠檬酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或磷酸缓冲液。在一个实施方案中，该低pH缓冲液为柠檬酸盐缓冲液。在一个实施方案中，该低pH缓冲液为磷酸缓冲液。
[0016]在一个实施方案中，该亲和色谱纯化包括两次亲和色谱纯化。在一个实施方案中，该方法包括亲和色谱纯化，之后是阴离子交换色谱。
[0017]在一个实施方案中，该洗脱还包括中和低pH缓冲液的pH。在一个实施方案中，中和包括添加Bis
‑
Tris丙烷(BTP)或Tris缓冲液。
[0018]在一个实施方案中，该洗脱还包括乙醇。在一个实施方案中，该乙醇为约5％至约40％。在一个实施方案中，该乙醇为约10％至约30％。在一个实施方案中，该乙醇为约15％至约25％。在一个实施方案中，该乙醇为约20％乙醇。
[0019]在一个实施方案中，当与未接触MNase的纯化的AAV颗粒相比时，所述纯化的AAV颗粒基本上不含染色质相关DNA。
[0020]在一个实施方案中，当与未接触MNase的纯化的AAV颗粒相比时，所述纯化的AAV颗粒基本上不含宿主细胞DNA。在一个实施方案中，宿主细胞DNA浓度小于2ng/mL。在一个实施方案中，宿主细胞DNA浓度小于1.5ng/mL。在一个实施方案中，宿主细胞DNA浓度小于1ng/mL。
[0021]在一个实施方案中，当与未接触MNase的纯化的AAV颗粒相比时，所述纯化的AAV颗粒基本上不含宿主细胞蛋白质。在一个实施方案中，当与未接触MNase的纯化的AAV颗粒相比时，纯化的AAV颗粒基本上不含DNA结合蛋白。在一个实施方案中，该DNA结合蛋白包括组蛋白。
[0022]在一个实施方案中，所述纯化的AAV颗粒基本上不含宏观和微观杂质。
[0023]在一个实施方案中，当与未接触MNase的纯化的AAV颗粒相比时，所述纯化的AAV颗粒包括增加的病毒滴度。在一个实施方案中，该病毒滴度包括物理滴度。在一个实施方案中，该病毒滴度包括功能滴度。在一个实施方案中，该病毒滴度增加约2倍至约100倍。在一个实施方案中，该病毒滴度增加约2倍或更大。在一个实施方案中，该病毒滴度增加约3倍或
更大。在一个实施方案中，该病毒滴度增加约7倍或更大。在一个实施方案中，该病毒滴度增加约80倍或更大。
[0024]在一个实施方案中，当与未接触MNase的纯化的AAV颗粒相比时，所述纯化的AAV颗粒包括产物AAV颗粒级分与后产物AAV颗粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于纯化腺相关病毒(AAV)颗粒的方法，所述方法包括：(a)使包含AAV颗粒的上清液与包含染色质
‑
DNA核酸酶的组合物接触；以及(b)纯化所述AAV颗粒。2.根据权利要求1所述的方法，其中纯化包括离心、色谱、过滤或它们的组合。3.根据权利要求2所述的方法，其中离心包括密度梯度离心、超速离心或它们的组合。4.根据权利要求2所述的方法，其中色谱包括亲和色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱或它们的组合。5.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括将包含AAV颗粒的所述上清液与固体支持体一起温育足够的时间量以结合所述AAV颗粒。6.根据权利要求5所述的方法，所述方法还包括洗涤所述固体支持体。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述洗涤包括高pH缓冲液。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述高pH缓冲液大于pH 9.0。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述高pH缓冲液在pH 9.0与pH 11之间。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述高pH缓冲液为约pH 9.5。11.根据权利要求7所述的方法，其中所述高pH缓冲液为约pH 10.2。12.根据权利要求7所述的方法，其中所述高pH缓冲液为约pH 10.3。13.根据权利要求7所述的方法，其中所述高pH缓冲液为约pH 10.4。14.根据权利要求4至13中任一项所述的方法，其中所述方法包括一次或多次亲和色谱纯化。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述亲和色谱包括离子交换色谱。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述离子交换色谱包括阴离子交换色谱。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述上清液是澄清的上清液。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述组合物还包含19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述温育持续约10分钟至约1小时。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述温育持续约20分钟至约40分钟。21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述温育持续约30分钟。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述染色质
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DNA核酸酶是微球菌核酸酶(MNase)。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述上清液中的所述MNase的浓度大于2.5单位/mL。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述上清液中的所述MNase的浓度大于10单位/mL。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述上清液中的所述MNase的浓度为约30单位/mL至约100单位/mL。26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述上清液中的所述MNase的浓度为约60单位/mL。27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中将所述MNase与含有结合的AAV颗粒的所述固体支持体一起温育。
28.根据权利要求5至27中任一项所述的方法，其中使用低pH缓冲液将所述AAV颗粒从所述固体支持体洗脱下来。29.根据权利要求28所述的方法，所述方法还包括所述低pH缓冲液之前的高pH缓冲液。30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述低pH缓冲液小于约pH3.0。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述低pH缓冲液为约pH 1.5至约pH 2.5。32.根据权利要求30所述的方法，其中所述低pH缓冲液为约pH 1.5。33.根据权利要求30所述的方法，其中所述低pH缓冲液为约pH 2.5。34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述低pH缓冲液为柠檬酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或磷酸缓冲液。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述低pH缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。36.根据权利要求34所述的方法，其中所述低pH缓冲液是磷酸缓冲液。37.根据权利要求14至36中任一项所述的方法，其中所述亲和色谱纯化包括两次亲和色谱纯化。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述方法包括亲和色谱纯化，之后是阴离子交换色谱。39.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，所述方法还包括中和所述低pH缓冲液的pH。40.根据权利要求39所述的方法，其中中和包括添加Bis
‑
Tris丙烷(BTP)或Tris缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：