一种基于a1离子的深度覆盖蛋白质组学定量方法技术

本发明专利技术涉及一种基于a1离子的深度覆盖蛋白质组学定量方法。该方法首先对生物样品使用蛋白质组预处理获得酶解肽段，然后使用二甲基试剂对肽段进行标记并进行二维或二维以上分离，进而使用多质量范围及优化的质谱参数进行数据采集，提取高质量范围的谱图信息并借助搜索引擎进行定性分析，提取低质量范围的a1离子强度进行定量分析。该方法避免了检测器采集过程中对高质量端离子的歧视效应以及高丰度a1离子对低丰度离子的信号掩盖，进而提升了覆盖深度。本发明专利技术能够高灵敏度、高覆盖度、高准确度、动态范围宽的实现蛋白质组样品的深度覆盖定量分析，从而广泛应用于生物样品在不同生长条件、疾病状态下的蛋白质表达、以及蛋白质的亚细胞定位和动态相互作用网络研究等，以深入了解复杂的蛋白质特性和行为。了解复杂的蛋白质特性和行为。了解复杂的蛋白质特性和行为。

【技术实现步骤摘要】
一种基于a1离子的深度覆盖蛋白质组学定量方法


[0001]本专利技术涉及一种基于a1离子的蛋白质组学深度覆盖定量方法，对生物样品使用蛋白质组预处理获得酶解肽段，经二甲基标记后结合二维或二维以上分离，并使用多质量范围及优化的质谱参数进行数据采集，显著提升了定量准确度、覆盖深度、动态范围等，可以应用于生物样品在不同生长条件、疾病状态下的蛋白质表达、以及蛋白质的亚细胞定位和动态相互作用网络研究，从而深入了解复杂的蛋白质特性和行为。

技术介绍

[0002]蛋白质作为生命活动的执行者，对其进行全面的定性和定量有助于帮助人们理解蛋白质在生物、生理和病理等生命过程中所起的作用(Mass Spectrom.Rev.2021,06,1)。随着液相色谱
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质谱(LC
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MS)的速度、灵敏度和分辨率的提高，以及数据处理算法等技术的进步，较定性而言更深入的定量蛋白质组学作为新兴领域已成为重要的研究内容之一(Anal.Bioanal.Chem.2012,404,939)，深入地对生物在不同状态下的差异蛋白质组分析可为理解生命活动提供重要信息(Anal.Chem.2013,85,8881)，进而应用于药物设计(Proteomics 2017,17,3)或基于生物标记物的诊断分析等领域(Nature 2019,567,257)。
[0003]蛋白质组学定量方法根据是否使用同位素标记可分为无标记的蛋白质组学定量方法(Proteomics 2008,8,994)和基于标记的蛋白质组学定量方法(Nat.Biotechnol.1999,17,994)。鉴于无标记的定量方法不需要同位素衍生、方法简单经济、无仪器限制，得到了广泛应用，但它在每次进样中容易受到保留时间偏移、电离效率变化和样品损失变化的影响(J.Chromatogr.A.2014,24,1365)。因此使用同位素标记同时分析多个样品可以避免上述多针注入带来的问题(Anal.Chem.2018,90,5032)，并具有更好的定量精度，更高的通量，减少了总分析时长。基于同位素标记的定量方法又可以分为基于母离子的的定量、基于报告离子的定量、基于肽段偶联报告离子的定量及基于碎片离子的定量。基于母离子的定量方法指对样品进行稳定同位素的轻、重标记后，通过提取一级谱中带有轻、重标记的成对的母离子峰面积，实现相对定量分析，包括同位素亲和标签(ICAT)(Methods Mol.Biol.2006,328,151)、二甲基化标记(Anal.Chem.2003,75,6843)、SILAC(Nat.Protoc.2011,6,147)等，这种方法通常需要标记后轻、重离子对至少相差4Da的质量位移以避免峰之间的交叠，从而限制了标记通量；同时对复杂的蛋白样品进行标记将进一步增加谱图的复杂性，从而导致肽识别率的下降，限制了覆盖深度。基于报告离子的定量指是等重标记试剂经过碎裂而在二级质谱中产生一系列的报告离子从而提取谱峰实现定量，商品化的实际包括二到十一标TMT(Anal.Chem.2003,75,1895；J.Proteome Res.2012,11,5081；Anal.Chem.2012,84,7469)，四标、八标iTRAQ(Mol.Cell.Proteomics2012,11,1；Methods Mol.Biol.2016,1362,277)，四到十二标DiLeu(Anal.Chem.2010,82,2817；Anal.Chem.2010,82,7588；Rapid Commun.Mass Spectrom.2015,29,1115；Anal.Chem.2018,90,12366；Anal.Chem.2015,87,1646)等，这种方法实现了很高的通量，其中TMTpro可以实现同时对16个样品进行定量(Nat.Methods 2020,17,399)，但由于报告离
子不具有肽段特异性，出峰时间相近、质量差小的肽段共碎裂从而导致比值压缩效应，虽然可以通过增加液相分离梯度(Mol.Cell.Proteomics 2012,11,M111.013722)、增加MS3分离步骤(Nat.Methods 2011,8,937)、离子迁移率分离(J.Proteome Res.2016,15,4653)等方法改善，但这些改善程度其实很有限。从根本上实现精准定量是使用肽段特异性的离子，如肽段偶联报告离子或碎片离子，其中碎片离子如使用标记后强度增加的a1离子，标记不会增加MS1的复杂性，可以在100倍的动态范围实现精准定量(Anal.Chem.2013,85,10658)。
[0004]为了进一步实现深度覆盖定量，相比于single
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shot蛋白质组学方法，进LC
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MS分析之前对样品进行进一步的多维分离可以显著帮助提升覆盖深度(Cell Systems 2017,04,587)，因为肽和蛋白质的分离可以增加LC分离峰值容量(Anal.Chem.2021,73,5683)。在LC/LC
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MS分析前加入离线的高pH反相分离(HpH)显示出较好的提升效果(Nature 2016,534,55)，结合FAIMS、气相分级等均可以进一步的提升深度。综上，通过使用多维分离结合a1离子的定量方法，有望实现高灵敏度、高覆盖度、高准确度、宽动态范围的定量，从而广泛应用于生物、医药等领域研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术发展了一种基于a1离子的深度覆盖定量方法，对生物样品使用蛋白质组预处理方法获得酶解肽段，并对肽段二甲基标记后进行二维或二维以上分离，然后使用多质量范围及优化的质谱参数进行数据采集，提取高质量范围的谱图信息并借助搜索引擎进行定性分析，提取低质量范围的a1离子强度进行定量分析。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]1、使用包括尿素、SDS、SDC、CHAPS、Triton X
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100、离子液体中的一种或二种以上的有机溶剂，按样品/有机溶剂体积比1:1至1:20加入样品进行蛋白质变性提取，然后每毫克蛋白加二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为100
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200mM，30
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100℃反应0.01
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2.0h,以实现蛋白质的还原；再按每毫克蛋白加入碘乙酰胺(IAA)至终浓度10
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400mM，避光条件下反应30
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60min，以实现蛋白质的烷基化；按照酶/蛋白比例为1:30至1:100(w/w)加入胰蛋白酶，37℃酶解孵育过夜得到肽段。
[0008]2、组合甲醛和NaBH3CN及其同位素形式对肽段进行标记，pH值控制在3.0～10.0，标记时间5～120min。
[0009]3、将标记样品混合，利用pH＝3
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6的酸性条件下的反相色谱分离(LpH RPLC)、pH＝8
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11的碱性条件下的反相色谱(HpH RPLC)、阳离子交换色谱(CEC)、阴本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于a1离子的深度覆盖蛋白质组学定量方法，其特征在于：对生物样品使用蛋白质组预处理获得酶解肽段，然后使用二甲基试剂对肽段进行标记并进行二维或二维以上分离，进而使用多质量范围及优化的质谱参数进行质谱数据采集，提取高质量范围的谱图信息进行定性分析，提取低质量范围的a1离子强度进行定量分析，最终获得深度覆盖的蛋白质组定量结果。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：蛋白质组预处理使用有机溶剂(包括尿素、SDS、SDC、CHAPS、Triton X
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100、离子液体中的一种或二种以上)对生物样品进行蛋白质变性提取，每毫克蛋白加二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为100
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200mM，30
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100℃反应0.01
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2.0h,以实现蛋白质的还原；再每毫克蛋白加碘乙酰胺(IAA)至终浓度10
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400mM，避光条件下反应30
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60min，以实现蛋白质的烷基化；按照酶/蛋白比例为1:30至1:100(w/w)加入胰蛋白酶，37℃酶解过夜得到肽段。3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：二甲基试剂标记采用二甲基试剂组合甲醛和NaBH3CN及其同位素形式对肽段进行标记，pH值控制在3.0～10.0，标记时间5～120min。4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：二维或三维以上分离包括pH＝3
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6的酸性条件下的反相色谱分离(LpH RPLC)、pH＝8
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11的碱性条件下的反相色谱(HpH RPLC)、阳离子交换色谱(CEC)、阴离子交换色谱(AEC)、体积排阻色谱(SEC)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
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PAGE)、毛细管电泳(CE)、高场非对称...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，王芷婷，刘健慧，杨开广，梁振，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：