肝癌药物的辅助治疗药物及应用和治疗肝癌药物混合物制造技术

目前大部分肿瘤的治疗方案都是手术切除辅助化疗，化疗耐药性现已成为影响肿瘤患者预后的重要因素。本发明专利技术提供了一种通过抑制FADS2从而增强肝癌细胞药物敏感性的肝癌治疗新方法。本发明专利技术发现肝癌耐药细胞中FADS2表达量上调，生存分析显示FADS2的高表达与肝癌不良预后有关，抑制FADS2可以显著增强肝癌细胞药物敏感性，从而达到治疗肝癌的目的。本发明专利技术的研究成果不仅为肝癌临床治疗提供理论基础，并能够为肝癌药物的开发提供新的药物靶点。并能够为肝癌药物的开发提供新的药物靶点。并能够为肝癌药物的开发提供新的药物靶点。

【技术实现步骤摘要】
肝癌药物的辅助治疗药物及应用和治疗肝癌药物混合物


[0001]本专利技术属于分子生物学和肿瘤防治领域，更具体而言，本专利技术涉及治疗肝癌耐药性领域。本专利技术提供了一种新的肿瘤耐药标志物。在肿瘤组织中高表达并导致肿瘤耐药的脂肪酸去饱和酶2(Fatty Acid Desatyrase2，FADS2)，将该蛋白作为靶点，可筛选针对该蛋白及其相关分子的治疗肿瘤耐药的药物。

技术介绍

[0002]作为我国最常见的恶性肿瘤之一的肝癌，具有高发病率、高死亡率的特点。目前，化疗仍是肝癌的主要治疗手段之一。然而，在治疗过程中出现的肝癌对化疗药物的耐药性是影响治疗效果的主要障碍。因此，为了提高肝癌化疗疗效，对肝癌耐药机制进行研究，找到肿瘤耐药关键靶点，设计能够提高肝癌治疗敏感性的新药，是本领域重点研究方向。
[0003]FADS2是一种由444个氨基酸组成的分子量为52.2k Da的膜蛋白；它包含一个细胞色素b5样结构域、两个跨膜结构域和三个富含组氨酸的结构域(区域I,II,III)。FADS2在乳腺癌、肺癌、肝癌、食道癌和黑色素瘤等恶性肿瘤中异常表达。此外，FADS2的高表达与肿瘤增殖、细胞迁移和侵袭、血管生成、放疗抗性、临床分期和预后显著相关。FADS2还可以通过调节肿瘤微环境中代谢物的产生或改变肿瘤细胞膜的磷脂组成来影响肿瘤细胞的行为。然而FADS2在肝癌索拉非尼耐药细胞中的功能和作用机制尚未见报道。为了研究FADS2在肝癌耐药中发挥的作用，本专利技术采用基于质谱的定量蛋白质组学技术筛选和生物学功能研究，运用Western blotting、平板克隆形成、等方法检测FADS2对肝癌耐药细胞增殖及凋亡的影响。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一是提供一种通过抑制FADS2从而增强肝癌细胞药物敏感性来实现肝癌治疗的方法。通过抑制FADS2，恢复肝癌耐药细胞对药物的敏感性，从而达到治疗肝癌的目的。
[0005]本专利技术的目的之二是提供一种检测肝癌耐药的分子靶点，为检测肝癌耐药性提供有效工具。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0007]本专利技术提供了抑制FADS2的方法，是通过抑制剂实现。
[0008]进一步，所述抑制剂包括了：针对FADS2蛋白抑制的抗FADS2的抗体、小分子抑制剂、针对FADS2编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸。
[0009]更进一步，所述抗FADS2的抗体，包括：对FADS2或其活性片段具有免疫活性，能够特异性识别并结合FADS2的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体、多克隆抗体和具有免疫活性的抗体片段。
[0010]本专利技术所述的抗体，其检测方式可通过免疫沉淀，免疫组织化学或免疫荧光。
[0011]本专利技术所述的小分子抑制剂可根据需要制备成各种剂型，可以单独给药，也可以
Galectin
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1as a Potential Biomarker for Predicting SorafenibResistance in Liver Cancer.Mol Cell Proteomics.14(6)(2015)1527
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45.)；未注明具体条件的实验方法，通常是按照常规条件，如Sambrook等人著，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用溶液中百分比如无特殊说明均为体积比。
[0028]实施例1.FADS2蛋白在肝癌索拉非尼耐药细胞HepG2
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R中高表达
[0029]为研究FADS2在正常肝癌细胞和肝癌耐药细胞中的表达水平，通过对肝癌细胞HepG2及索拉非尼耐药细胞HepG2
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R的无标定量蛋白质组学分析发现，FADS2在HepG2
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R中的丰度明显高于HepG2中。采用蛋白质印迹法(参考《分子克隆》)进一步检测两种细胞中FADS2蛋白表达水平。
[0030]分别在10cm培养皿培养HepG2
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R细胞和细胞HepG2，当细胞密度达80％
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90％时(5
×
106个细胞)，首先用6ml PBS(pH 7.4)(购买于美国Gibco公司)洗3次，再加入300μl的RIPA裂解液(购买于上海碧云天生物技术有限公司，裂解液主要成分为50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1％Triton X
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100，1％sodium deoxycholate，0.1％SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂)，冰上裂解细胞15min，12000g离心15min，去除沉淀获得蛋白质上清液。分别用BCA试剂盒(购买于上海碧云天生物技术有限公司)测定蛋白质浓度。分别采用蛋白质印迹法检测FADS2蛋白质表达水平,每个泳道的蛋白样品上样量为50μg。Bio rad电泳仪，Bio rad转膜仪购买于美国Bio rad公司，FADS2的抗体购买于美国Gene Tex公司,货号GTX64748。HSP90抗体做内参，购买于Santa Cruze公司，货号SC
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7947。
[0031]结果显示FADS2在肝癌索拉非尼耐药细胞HepG2
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R中蛋白表达水平明显高于对照细胞HepG2，表明FADS2的表达与肝癌耐药具有关联。
[0032]实施例2.抑制FADS2表达提高了肝癌耐药细胞对索拉非尼药物敏感性
[0033]1.siRNA设计合成
[0034]根据FADS2基因序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成siRNA1，并同时提供与FADS2基因无序列同源性的阴性对照siRNA(siRNA NC)。
[0035]siRNA NC
[0036]正义链:5'
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UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
‑
3'
[0037]反义链:5'
‑
ACGUGACACGUUCGGAGAATT
‑
3'
[0038]siRNA1FADS2正义链:5'
‑
ACGGCAAGAACUCAAAGAUTT
‑
3'；
[0039]反义链:5'
‑
AUCUUUGAGUUCUUGCCGUGG
‑
3'；
[0040]siRNA2FADS2,正义链:5'
‑
ACCUGUCUGUCUACAGAAATT
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3'；
[0041]反义链:5'
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UUUCUGUAGACAGACAGGUGG
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3'；
[0042]2.细胞转染
[0043]取生长良好且处于对数生长期的HepG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝癌药物的辅助治疗药物，其以肝癌细胞的FADS2蛋白抑制剂为活性成份。2.如权利要求1所述的辅助治疗药物，其特征在于，所述FADS2抑制剂选自下述中的一种或两种以上：针对FADS2蛋白抑制的抗FADS2的抗体、针对FADS2编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸中的一种或两种以上、针对FADS2的小分子抑制剂。3.如权利要求2所述的辅助治疗药物，其特征在于：抗FADS2的抗体包括：对FADS2或其活性片段具有免疫活性，能够特异性识别并结合FADS2的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体、多克隆抗体和具有免疫活性的抗体片段中的一种或两种以上；所述的针对FADS2编码序列的RNA干扰分子选自：shRNA、siRNA、miRNA、dsRNA中的至少一种或两种以上；所述的反义寡核苷酸为：特异地与FADS2基因DNA或mRNA结合而抑制FADS2基因表达，在基因水平调控的分子药物，包括人工合成或体内表达的反义DNA和反义RNA中的一种或两种以上。4.如权利要求2所述的辅助治疗药物，其特征在于：RNA干扰分子siRNA的序列为下述中的一种或两种以上，siRNA1，正义链:5'
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ACGGCAAGAACUCAAAGAUTT
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3'和反义链:5'
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AUCUUUGAGUUCUUGCCGUGG
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3'；siRNA2，正义链:5'
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ACCUGUCUGUCUACAGAAATT
‑
3'和反义链:5'
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UUUCUGUAGACAGACAGGUGG
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3'；siRNA3，正义链:5'
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【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，张堃，王子璇，褚宏伟，马宝福，潘慧，赵宝锋，梁振，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：