HOGG1辅助的镧系元素标记法用于DNA甲基化检测制造技术

本发明专利技术提出了一种基于镧系元素标记的电感耦合等离子体质谱法用于DNA甲基化检测，该方法利用人类8

【技术实现步骤摘要】
HOGG1辅助的镧系元素标记法用于DNA甲基化检测


[0001]本专利技术涉及核酸检测
，特别是涉及一种人类8
‑
氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)辅助的镧系元素标记的检测方法。

技术介绍

[0002]DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，在哺乳动物的基因组中几乎所有的DNA甲基化都发生在CG二核苷酸胞嘧啶的5号碳位，并且它与胚胎发育、基因沉默以及X染色体失活密切相关。异常的DNA甲基化水平与多种人类疾病有关，例如：癌症、阿尔兹海默症等。因此，对基因组中DNA甲基化水平的评估已经成为一些人类疾病早期诊断及预后治疗的重要指标。
[0003]目前，DNA甲基化的检测方法主要有甲基化敏感的限制酶消化法(MSRE)和亚硫酸氢盐转化法。MSRE可以选择性地识别和切割特定的未甲基化序列，同时保护甲基化序列不被切割。但MSRE只能识别特定的某些序列，这限制了该方法在DNA甲基化检测中更广泛的应用。亚硫酸氢盐转化法可使正常的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶(5mC)不会受到影响。亚硫酸氢盐转化法已成为DNA甲基化检测的金标方法，它可以以单碱基分辨率检测任何甲基化位点。这两种方法通常会与一些核酸放大技术联用，过程耗时、操作复杂，并且容易出现假阳性结果。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于人类8
‑
氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶（hOGG1）辅助的镧系元素标记电感耦合等离子体质谱法用于DNA甲基化检测，该方法假阳性概率低、耗时较短，并且无需任何核酸扩增步骤即可实现对DNA甲基化的灵敏检测。
[0005]本专利技术的基于hOGG1辅助的镧系元素标记的电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）用于DNA甲基化检测，包括以下步骤：1、 含有特异性位点探针的制备；2、将目标DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；3、将步骤2的产物与步骤1合成的探针以及hOGG1进行反应；4、将步骤3的产物进行磁性分离，收集上清液，送至ICPMS检测；5、根据测得结果，计算测得目标DNA含量。
[0006]步骤1中，所述探针为寡核苷酸探针，其序列与部分目标DNA互补，并且包含3个部分：（1）5末端修饰磁珠；（2）3末端修饰镧系元素；（3）中间修饰氧化性损伤位点（8
‑
oxo
‑
G），该位点的修饰不影响碱基互补配对。
[0007]步骤3中，收集的上清液需用1%的硝酸溶液稀释至800μL，再进行ICPMS检测。
[0008]本专利技术的DNA甲基化检测方法，利用标记了镧系元素的含有氧化性损伤的特定序列探针，与经亚硫酸氢盐转化后的目标DNA杂交互补形成含有8
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oxo
‑
G/U或8
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oxo
‑
G/5mC两种碱基对。同时，根据人类8
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氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶（hOGG1）能够特异性识别8
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oxo
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G/5mC
碱基对并剪切8
‑
oxo
‑
G位点的特性，将甲基化DNA与未甲基化DNA有效区分。与常用的核酸放大策略相比，本专利技术的方法耗时较短，并且无需任何核酸扩增步骤即可实现对DNA甲基化的灵敏检测。不仅节省了检测时间和成本，还能避免过度扩增带来的假阳性。
附图说明
[0009]图1是专利技术实施例1的检测结果图。
[0010]图2是专利技术实施例2的检测结果图。
[0011]图3是专利技术实施例3的检测结果图。
[0012]图4是专利技术实施例4甲基化MLH1 DNA在血清中加标回收的结果。
具体实施方式
[0013]下面结合附图和实施例，对本专利技术作进一步详细的说明。
[0014]以下实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0015]实施例1：MLH1基因的DNA甲基化检测（1）MLH1基因序列如下：甲基化的MLH1：5
’‑
CCAATAGGAAGAG5mCGGACAG
‑3’
未甲基化的MLH1：5
’‑
CCAATAGGAAGAGCGGACAG
‑3’
上述序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。
[0016]（2）亚硫酸氢盐转化由美国ZYMO RESEARCH公司生产的EZ DNA methylation
‑
gold
‑
kit完成，处理后正常的胞嘧啶（C）会转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不变。
[0017]（3）含有8
‑
oxo
‑
G位点的镧系元素标记探针的合成本实施例的探针序列如下：5
’
biotin
‑
TTTTTTTTTTATCC/8
‑
oxo
‑
G/CTCTTCCTTTTTTTTTTT
‑3’
SH上述探针由生工生物工程（上海）有限公司合成。
[0018]将20mM氯化铥溶液与10mM大环化合物溶液（MMA
‑
DOTA）以摩尔比1.5：1的比例混合，并在37
°
C温度条件下反应1小时，得到浓度为5.71mM大环化合物与镧系元素铥的螯合物（MMA
‑
DOTA
‑
Tm）。然后用0.5M pH=5.8的醋酸铵溶液将探针DNA溶解为浓度100μM的溶液，将MMA
‑
DOTA
‑
Tm与探针DNA以摩尔比25：1的比例混合均匀，在37℃条件下反应2小时，将MMA
‑
DOTA
‑
Tm连接到探针DNA的3末端。得到的产物转移至10k超滤管中，以14000rpm离心15分钟，丢弃滤液，再用2
×
B&W缓冲液洗5次。最终产物为3末端标记了Tm的探针DNA，稀释至一定浓度保存在4℃冰箱备用。
[0019]然后，取一定量的磁珠用2
×
B&W缓冲液洗涤3次，然后分散在制备好的含有8
‑
oxo
‑
G位点的镧系元素探针中，25℃孵育1小时，以将标记了Tm的探针DNA固定在磁珠表面。反应结束后用1
×
B&W缓冲液清洗1次，用超纯水清洗2次。最终产物为5末端连接磁珠、3末端标记了Tm的寡核苷酸探针（MBs
‑8‑
oxo
‑
G DNA
‑
Tm），将其分散在超纯水中，储存在4℃冰箱备用。
[0020]（4）与hOGG1的反应
反应总体积为40μL含有1
×
NEB buffer 2.0、0.5
×
BSA、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.HOGG1辅助的镧系元素标记法用于DNA甲基化检测，其特征在于包括以下步骤：（1）样本DNA的准备；（2）亚硫酸氢盐处理样本DNA，亚硫酸氢盐处理能将正常的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而被甲基化的胞嘧啶则保持不变；（3）含有氧化性损伤位点（8
‑
oxo
‑
G）的镧系元素标记的寡核苷酸探针的制备；（4）将步骤（3）的探针与步骤（2）处理后的样本DNA杂交互补，形成8
‑
oxo
‑
G/U和8
‑
oxo
‑
G/5mC碱基对；然后再利用人类8
‑
氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶（hOGG1）选择性识别8
‑
oxo
‑
G/5mC碱基对的特性，去识别...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕弋，周静，刘睿，宋红杰，张立春，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：