一种菜籽粕硫代葡萄糖苷检测方法技术

本发明专利技术属于农产品检测领域，具体涉及一种应用液相色谱串联质谱(LC

【技术实现步骤摘要】
一种菜籽粕硫代葡萄糖苷检测方法
一、

[0001]本专利技术为采用LC
‑
MS测定菜籽粕中硫代葡萄糖苷(简称硫苷)含量的方法，属于农产品检测

二、
技术介绍

[0002]硫苷是由一个磺酸肟、一个硫代葡萄糖和一个可变的侧链组成的一大类化合物。作为菜籽粕中最主要的抗营养因子，硫苷摄入后会在胃肠道内被降解生成异硫氰酸酯、噁唑烷硫酮及腈类等物质，可能对机体的肝脏、肾脏、甲状腺及生殖系统产生毒害作用，并且其具有的刺激性气味也会影响食品的风味和食用品质。目前，越来越多的研究集中在菜籽粕中硫苷的降解和菜籽资源的利用。因此，发展先进的硫苷检测技术具有重要的意义。
[0003]当前，硫苷的检测方法分为间接测定和直接测定两类，其中间接测定原理是硫苷在酶的作用下解离得到葡萄糖、硫酸盐和其它含硫化合物，通过测定降解产物或衍生物的量，换算得到硫苷总量。间接测定法通常只能测定样品中硫苷的总量，并且结果容易受到样品内源葡萄糖等物质的影响，难以满足对于菜籽粕中不同硫苷的含量进行精确定量的要求。目前报道的直接测定方法有酶联免疫吸附法、气相色谱法和高效液相色谱法等，都有不同的缺陷。比如酶联免疫吸附法受限于硫苷种类，不能用于某些硫苷的定量；气相色谱法测定前需要用三甲基硅烷化试剂与脱硫硫苷反应，得到具有挥发性的衍生物，因此难以用于定量易于热解的吲哚类硫苷；高效液相色谱法虽然可以用于吲哚族硫苷的定量，但仍需预先进行脱硫处理以消除硫酸根的影响，而脱硫时间和硫酸酯酶浓度的确定往往存在困难。
[0004]本方法借助LC/>‑
MS/MS技术，可以对菜籽粕中的硫苷进行快速而且准确的测定，具有很高的实用价值。
三、
技术实现思路

[0005]本专利技术申请人首先借助于超高效液相色谱
‑
串联四极杆飞行时间质谱 (UPLC
‑
Triple
‑
TOF
‑
MS/MS)技术鉴定了菜籽粕中硫苷的种类和浓度，发现2
‑
羟基
‑3‑
丁烯基硫苷、3
‑
丁烯基硫苷、4
‑
戊烯基硫苷、4
‑
甲基硫氧基丁基硫苷、2
‑
丙烯基硫苷、2
‑
苯基乙基硫苷这六种硫苷的含量占菜籽粕中硫苷总量的90％以上。此后，本专利技术申请人进一步建立了用 LC
‑
MS/MS测定菜籽粕中这六种硫苷的方法，适用于大批量、快速、高效地检测菜籽粕中硫苷的含量。具体方案如下：
[0006](1)菜籽粕硫苷提取：将菜籽粕粉碎后过60目筛，取筛下部分然后过100目筛取筛上部分，加入体积分数为50％～70％的甲醇溶液，质量体积比为1∶3～6(g/mL)，70℃水浴20min；后向样品中加入石英砂充分研磨；将研磨后的浆液在70℃下再水浴20min，然后4℃下16000 g离心，吸取上清液至平底烧瓶；将残渣用50％～70％甲醇重复提取离心2次，合并上清液至平底烧瓶；将上清液在40～45℃下真空旋蒸至恒重，过0.22μm水系滤膜，即为硫苷提取液。
[0007](2)菜籽粕硫苷的定量分析：运用LC
‑
MS/MS对提取液中硫代葡萄糖苷进行定量。其
中，色谱柱为Kinetex 2.6μm F5 100A(2.1mm
×
100mm，Phenomenex)，流动相为2mM甲酸铵和乙腈，洗脱流程为：在0.0min～1.0min～5.0min～6.0min～6.0min～8.0min内乙腈线性梯度按 2％～2％～98％～98％～2％～2％依次变化，流速为0.3mL/min，进样量为1μL；采用电喷雾离子源；负离子多重反应监测扫描；碰撞活化参数为8；气帘气为35psi；雾化气为55psi；辅助气为55psi；离子源电压为
‑
4500V；离子源温度为550℃。
[0008](3)六种硫苷的特征离子对(Da)如下：2
‑
羟基
‑3‑
丁烯基(97、75、342)、 3
‑
丁烯基(97、75、195)、4
‑
戊烯基(97、75、259)、4
‑
甲基硫氧基丁基(178、372)、2
‑
丙烯基(97、75、259)、2
‑
苯基乙基硫苷(97、75、259)。
[0009](4)六种硫苷的碰撞电压(V)如下：2
‑
羟基
‑3‑
丁烯基(
‑
40、
‑
42、
‑
28)、3
‑
丁烯基(
‑
28、
ꢀ‑
28、
‑
28)、4
‑
戊烯基(
‑
28、
‑
42、
‑
28)、4
‑
甲基硫氧基丁基(
‑
34、
‑
28)、2
‑
丙烯基(
‑
28、
‑
42、
ꢀ‑
28)、2
‑
苯基乙基硫苷(
‑
28、
‑
42、
‑
30)；去簇电压(DP)均为
‑
80。
[0010](5)标准工作曲线绘制：将硫代葡萄糖苷标准物质按照公知的方法用超纯水配制成一定浓度梯度的标准工作液，然后分别按菜籽粕硫苷的离子对进行LC
‑
MS/MS分析，采集数据，绘制标准工作曲线，可得到反映各种硫代葡萄糖苷浓度与其色谱峰面积关系的回归方程，借此对菜籽粕硫代葡萄糖苷进行外标法定量。
[0011]有益效果：
[0012]与现有技术相比，本专利技术的一种菜籽粕硫苷检测方法具有以下优点：
[0013](1)本专利技术中检测所需样品量少，样品前处理主要是采用50％～70％甲醇提取硫苷，操作简单，耗时短，无需任何特殊试剂。
[0014](2)本专利技术中每个样本的LC
‑
MS/MS分析时间只有4～8min，检测效率高，且进样量仅为 1μL，检出限低，灵敏度高。
[0015](3)本专利技术可同时检测多种硫苷，并进行精确地定性和定量分析。
四、附图说明
[0016]附图1菜籽粕中硫苷的一、二级质谱图
[0017]使用超高效液相色谱
‑
串联四极杆飞行时间质谱(UPLC
‑
Triple
‑
TOF
‑
MS/MS)技术鉴定菜籽粕中的硫苷，共检出11中硫苷。
[0018]附图2六种硫苷的标准曲线
[0019]附图3菜籽粕中硫苷种类
[0020]UPLC
‑
Triple
‑
TOF
‑
MS/MS检出11种硫苷的分子量、信号本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菜籽粕硫代葡萄糖苷的检测方法，其特征在于，将菜籽粕中的硫代葡萄糖苷通过提取后，用液相色谱串联质谱技术(LC
‑
MS/MS)对菜籽粕中六种主要硫代葡萄糖苷进行定量检测，具体包括以下步骤：(1)菜籽粕硫苷提取：将菜籽粕粉碎后过60目筛，取筛下部分然后过100目筛取筛上部分，加入体积分数为50％～70％的甲醇溶液，质量体积比为1∶3～6(g/mL)，70℃水浴20min；后向样品中加入石英砂充分研磨，将研磨后的浆液在70℃下再水浴20min，然后4℃下16000g离心，吸取上清液至平底烧瓶；将残渣用50～70％甲醇重复提取离心2次，合并上清液至平底烧瓶；将上清液在40～45℃下真空旋蒸至恒重，过0.22μm水系滤膜，即为硫代葡萄糖苷提取液；(2)菜籽粕硫苷的定量分析：运用LC
‑
MS/MS对提取液中硫代葡萄糖苷进行定量，其中，色谱柱为Kinetex 2.6μm F5 100A(2.1mm
×
100mm，Phenomenex)，流动相为2mM甲酸铵和乙腈，洗脱流程为：在0.0min～1.0min～5.0min～6.0min～6.0min～8.0min内乙腈线性梯度按2％～2％～98％～98％～2％～2％依次变化，流速为0.3mL/min，进样量为1μL；采用电喷雾离子源；负离子多重反应监测扫描；碰撞活化参数为8；气帘气为35psi；雾化气为55psi；辅助气为55psi；离子源电压为
‑
4500V；离子源温度为550℃；(3)标准工作曲线绘制：将硫代葡萄糖苷标准物质按照公知的方法用超纯水配制成一定浓度梯度的标准工作液，然后分别按菜籽粕硫代葡萄糖苷的定量离子对进行LC
‑
MS/MS分析，采集数据，绘制标准工作曲线，可得到反映各种硫代葡萄糖苷浓度与其色谱峰面积关系的回归方程，借此对菜籽粕硫代葡萄糖苷进行外标法定量。2.根据权利要求1所述，其特征在于，所检测的6种硫代葡萄糖苷分别为2
‑
羟基
‑3...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢翀，闫丽华，杨润强，王沛，顾振新，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：