一种提高重组人白蛋白表达量的方法和细胞和蛋白技术

本发明专利技术公开了一种提高重组人白蛋白表达量的方法和细胞和蛋白，属于生物制药技术领域。本发明专利技术通过在表达重组人白蛋白的同时，减弱、破坏或去除至少一个编码絮凝蛋白的内源基因的功能，和/或编辑内源基因或异源基因使得超氧化物歧化酶过表达；和/或编辑内源基因或异源基因使得E3泛素连接酶过表达。从而提高重组人白蛋白的表达量。组人白蛋白的表达量。组人白蛋白的表达量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种提高重组人白蛋白表达量的方法和细胞和蛋白


[0001]本专利技术涉及提高重组人白蛋白表达量的方法，尤其涉及一种提高重组人白蛋白表达量的方法和细胞和蛋白。

技术介绍

[0002]巴斯德毕赤酵母遗传稳定，拥有强有力的受严格调控的启动子，有适合真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统。操作简单，可大规模高密度培养发酵，是近年来使用非常广泛的一种生产蛋白质的真核表达系统。
[0003]酵母具有无性繁殖和有性繁殖两种繁殖方式。酵母无性繁殖时，当受到外界环境压力刺激时，会导致酵母的絮凝现象，环境压力较大时通常死亡。而有性繁殖是相邻的两个性别不同的酵母交配，单倍体孢子融合产生双倍体，在环境恶劣时，减数分裂，双倍体减数分裂产生单倍体孢子。
[0004]酵母絮凝是一个无性的、可逆的、钙依赖的过程，是由絮凝基因编码的絮凝蛋白与邻近细胞壁上的甘露糖结合而形成的多细胞聚集现象。细胞过早絮凝后，会从发酵液中沉淀，从而可能导致发酵的不完全。减弱、破坏或去除至少一个编码絮凝蛋白的内源基因的功能，包含FLO5、FLO8和FLO11，从而抑制假菌丝的形成。在培养基中加入甘露糖，使其占据絮凝蛋白的结合位点，无法与邻近细胞壁上的甘露糖残基结合，使得絮凝作用被抑制。
[0005]酵母细胞内的氧化还原状态直接影响细胞的生存、活化和增殖，当利用甲醇作为碳源时，甲醇在醇氧化酶作用下被分解为甲醛以及过氧化氢，而过氧化氢在代谢过程中会产生大量的活性氧(ROS)，会导致对核酸、脂质、蛋白质等细胞组分直接损伤，严重时还会引起细胞衰老或死亡。超氧化物歧化酶能够催化超氧阴离子自由基生成过氧化氢和氧气。有效抵御超氧根离子对细胞的毒性，保护机体免遭氧化损伤，维持机体平衡，延长细胞寿命。
[0006]在酵母细胞中，内质网是分泌蛋白质合成和成熟的重要场所，其中富含协助蛋白质折叠和修饰的各种分子伴侣、折叠酶等，如蛋白二硫键异构酶PDI。PDI能够催化半胱氨酸残基间二硫键的形成和重排，帮助蛋白质的正确折叠，提高其表达量。
[0007]人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)是一种单链球形蛋白质，由585个氨基酸构成。蛋白质在二硫键形成以及由内质网向高尔基体转运等过程受阻时，未折叠或错误折叠的蛋白质聚集在内质网中，引起内质网压力，从而影响细胞正常功能。调控内质网压力的途径主要有两种，即未折叠蛋白反应(UPR)和内质网相关降解途径(ERAD)。UPR借助细胞内的一系列信号传导反应，上调折叠酶和分子伴侣的表达量来提高蛋白质的折叠能力；ERAD则通过逆转运方式将不能正确折叠的蛋白底物从内质网运至细胞质中，进一步通过泛素化标记最终被蛋白酶体降解。
[0008]泛素蛋白酶体途径由泛素以及一系列相关的酶组成。泛素激活酶E1依赖ATP供给的能量，将泛素分子活化，并传递给泛素结合酶E2，泛素连接酶E3识别待降解的靶蛋白，将结合E2的泛素连接到靶蛋白的Lys残基上，重复此过程，使得靶蛋白与多个泛素结合。在26S蛋白酶体作用下，将其降解成氨基酸残基组成的小肽。蛋白酶体本身对蛋白质没有选择性，
具有选择特异性的是E3泛素连接酶。
[0009]定义术语“宿主细胞”指在转化或转导过程中接受外源基因的细胞。
[0010]“表达盒”指包含外源蛋白表达所需的所有必要元件的基因表达系统，包括启动子、外源基因克隆位点、信号肽序列、目的蛋白的成熟肽编码序列、终止子、筛选标记等。
[0011]“载体”指能将外源DNA带入宿主细胞，进行复制或最终使外源基因DNA得以表达的自主DNA。主要分为克隆载体和表达载体，前者主要用于基因的复制、扩增等，后者主要用于目的基因的表达。
[0012]“DNA”Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。
[0013]“基因表达”指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定生物学功能的过程。
[0014]“可操作的连接”指转录和翻译调控元件共价连接至编码序列，其空间排布使得调控元件可以指导编码序列的表达。
[0015]“信号肽”指新合成的多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N端氨基酸序列。
[0016]“分子伴侣”指协助细胞内大分子结构正确折叠的蛋白质和多肽。
[0017]“重组启动子”指经遗传修饰的或未经修饰的启动子，不天然存在于基因组中基因上游的启动子或野生型启动子。存在于目的基因编码序列5
’
端上游，与RNA聚合酶识别、结合的特异DNA序列，控制目的基因的转录。
[0018]“FDH”Formate dehydrogenase，甲酸脱氢酶。
[0019]“FLD”Formaldehyde dehydrogenase，甲醛脱氢酶。
[0020]“GAL”Galactose，半乳糖。
[0021]“GAP”Glyceraldehyde
‑3‑
phosphate dehydrogenase，三磷酸甘油醛脱氢酶。
[0022]“UPR”unfolded protein response，未折叠蛋白反应。
[0023]“ERAD”ER associated degradation，内质网相关降解途径。
[0024]“ROS”Reactive Oxygen Species，活性氧。
[0025]“HSA”Human Serum Albumin，人血清白蛋白。
[0026]“PDI”Protein Disulfide Isomerase，蛋白二硫键异构酶。
[0027]“LB”Luria bertani medium，培养基。
[0028]“MD”Minimal Dextrose medium，培养基。
[0029]“BMGY”Buffered Glycerol
‑
complex Medium，培养基。
[0030]“BMMY”Buffered Methanol
‑
complex Mdeium，培养基。
[0031]“YPD”Yeast extract/peptone/dextrose
‑
media，培养基。
[0032]“Zeo”zeocin，博来霉素。
[0033]“His”Histidinol dehydrogenase，组氨酸脱氢酶。
[0034]“Da”Dalton，道尔顿。
[0035]“ml”milliliter，毫升。
[0036]“Mut
s”Methanol utilization slow，甲醇利用慢表型。
[0037]“Mut
+”Methanol utilization plus，甲醇利用快表型。
[0038]“PCR”Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。
[0039]“rpm”本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，所述方法的宿主细胞在表达重组人白蛋白的同时，还包含如下操作：减弱、破坏或去除至少一个编码絮凝蛋白的内源基因的功能；和/或编辑内源基因或异源基因使得超氧化物歧化酶过表达；和/或编辑内源基因或异源基因使得E3泛素连接酶过表达。2.如权利要求1所述的一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，所述的宿主细胞为酵母细胞。3.如权利要求1所述的一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，所述的编码絮凝蛋白的内源基因包含FLO5、FLO8和FLO11。4.如权利要求1所述的一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，所述的编码超氧化物歧化酶的内源或异源基因是经遗传修饰的或未经遗传修饰的；编码E3泛素连接酶的内源或异源基因是经遗传修饰的或未经遗传修饰的。5.如权利要求1所述的一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，编码超氧化物歧化酶的基因是酵母超氧化物歧化酶基因；或者编码超氧化物歧化酶的基因是人铜锌超氧化物歧化酶核酸分子基因。6.如权利要求1所述的一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，编码E3泛素连接酶的基因是酵母E3泛素连接酶；或者编码E3泛素连接酶的基因为人E3泛素连接酶核酸分子。7.如权利要求2所述的一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，所述的酵母细胞为如下酵母属的一种或者多种：汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)和假丝酵母属(Candida)。8.如权利要求7所述的一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母属的细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。9.如权利要求1所述的一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，编码人白蛋白基因、编码超氧化物歧化酶基因和编码E3泛素连接酶的基因的重组表达盒是在一个核酸构建体上或在不同选择标志的核酸构建体上。10.如权利要求9所述的一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，所述核酸构建体包括pHIL
‑
D2、pPIC3.5、pHIL
‑
S1、pPIC9、pPink
‑
LC、pPink
‑
HC、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pPICZaA、pPICZaB和pPICZaC质粒中的任意一种或者多种；重组启动子包括AOX1启动子、GAP启动子、GAL启动子、FDH启动子和FLD启动子中的任意一种或者多种。11.如权利要求10所述的一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，宿主细胞中编码至少一个重组启动子修饰的人白蛋白；宿主细胞中编码至少一个重组启动子修饰的超氧化物歧化酶；宿主细胞中编码至少一个重组启动子修饰的E3泛素连接酶。12.如权利要求1
‑
11任意一项所述的一种提高重组人白蛋白表达量的方法，其特征在于，用到的序列为如下任意一种或者多种序列：SEQ ID NO.1酿酒酵母交配因子信号肽编码序列SEQ ID NO.2人白蛋白信号肽编码序列；SEQ ID NO.3人白蛋白成熟肽编码序列；SEQ ID NO.4酵母超氧化物歧化酶编码序列；
SEQ ID NO.5人超氧化物歧化酶编码序列；SEQ ID NO.6酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：项炜，龚国利，
申请(专利权)人：通化安睿特生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：