通过疮痂病链霉菌中转录因子基因bldD改变thaxtominA生物合成的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过疮痂病链霉菌中转录因子基因bldD改变thaxtomin A生物合成的方法，通过基因工程途径对疮痂病链霉菌中的转录因子基因bldD进行缺失或/过表达，从而获得bldD基因缺失突变株/bldD基因过表达菌株；bldD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过基因工程技术所获得的改造菌株可以减少或增加疮痂病链霉菌次级代谢物thaxtomin A的生物合成，其中，减少thaxtomin A生物合成的突变株，用于减轻疮痂病，为农业生产上防治马铃薯疮痂病提供新的理论支持；增加thaxtomin A生物合成的突变株，可用作除草剂。可用作除草剂。可用作除草剂。

【技术实现步骤摘要】
通过疮痂病链霉菌中转录因子基因bldD改变thaxtomin A生物合成的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种通过疮痂病链霉菌中转录因子基因bldD改变thaxtomin A生物合成的方法。

技术介绍

[0002]链霉菌是一种G+C含量高达70％～74％的革兰氏阳性丝状细菌，迄今为止已经鉴定出超过580种链霉菌。链霉菌能产生众多结构复杂、功能多样的次生代谢产物，其代谢产物广泛应用于医药健康、畜牧业、工业以及农业除草剂中。链霉菌中次级代谢产物的合成基因大多数以成簇的形式位于基因组中，而合成基因簇受到多种调控基因的调控。在遗传水平,链霉菌次级代谢调控有三个层次，分别是：途径特异性调控、多效调控和全局调控。通过一系列的基因改造可以影响链霉菌次级代谢产物的合成，研究次级代谢调控的分子机制将对利用基因工程手段得到理想的工程改造菌株应用于实际生产具有极大的促进作用。本专利技术目的就是通过基因工程途径定向改变基因来获得疮痂病链霉菌工程改造菌株，用于农业生产上马铃薯疮痂病的防治。
[0003]链霉菌大属中相对较少的物种具有致病性，疮痂病链霉菌是引起马铃薯疮痂病的主要致病菌之一，自疮痂病发生以来，其对马铃薯的危害及整个马铃薯产业的影响受到了广泛的关注，随着国内外研究学者对疮痂病病原、致病毒素和防治等方面的研究逐步深入，目前已取得了较好的研究进展。疮痂病链霉菌次级代谢产生的thaxtomin是马铃薯疮痂病的主要致病原因，thaxtomin作为一种纤维素合成抑制剂会导致马铃薯块茎表面的软木状病变。Thaxtomins是一类具有独特的2,5
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二酮哌嗪结构的化合物，通过阻断植物细胞扩张和分裂过程中纤维素的合成而引发疮痂病。疮痂病不仅严重影响马铃薯的产量和质量，还能侵染萝卜、甜菜、胡萝卜等主要作物，甚至包括中药植物防风草。
[0004]Thaxtomin A是thaxtomins家族中代谢量最多、活性最显著且结构最具代表性的产物。thaxtomin A的特征结构单元是4
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硝基吲哚和C
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羟基
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哌嗪二酮环，其中4
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硝基吲哚为thaxtomins家族在所有微生物次代谢产物中所独有的化学结构单元，C
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羟基
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哌嗪二酮环，则存在于很多具有生物活性的天然产物。Thaxtomin A的生物合成基因簇(txt cluster)是由txtC、txtH、txtB、txtA、txtR、txtE和txtD共计7个基因依次排列组成的，研究表明thaxtomin A的生物合成受到其生物合成基因簇中转录调控因子TxtR和簇外BldD等转录调控因子的调控。
[0005]BldD蛋白是链霉菌中已经研究较为成熟的全局性转录调控因子，能够显著地调控链霉菌的气生菌丝形成、孢子产生、抗生素合成等多个重要的生物进程。bld光秃型基因可调控链霉菌次生代谢与形态分化。bld家族包括bldA、bldB、bldC、bldD、bldG、bldH等。其中对bldD基因的调控机制研究得较清楚。例如在天蓝色链霉菌中BldD作为一个全局性的调控子可以调控167个转录单元，其中包括影响分化的调控基因和影响次级代谢的调控基因。基于疮痂病链霉菌基因组序列的生物信息学预测，疮痂病链霉菌SCAB_75171基因是bldD转录
调控家族基因，并且经本实验室研究发现，疮痂病链霉菌转录因子基因bldD是一个参与thaxtomin A生物合成的正调控因子。
[0006]据此，目前急需一种通过疮痂病链霉菌转录因子基因bldD改变thaxtomin A生物合成的方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种通过疮痂病链霉菌中转录因子基因bldD改变thaxtomin A生物合成的方法。
[0008]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0009]一种通过疮痂病链霉菌中转录因子基因bldD改变thaxtomin A生物合成的方法，通过基因工程途径对疮痂病链霉菌中的转录因子基因bldD进行缺失或/过表达，从而获得bldD基因缺失突变株/bldD基因过表达菌株，利用所得菌株生产thaxtomin A；其中，bldD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]作为本专利技术的优选方式之一，所述bldD基因的基因产物正向调控thaxtomin A的生物合成。
[0011]作为本专利技术的优选方式之一，所述bldD基因缺失突变株，是以疮痂病链霉菌87.22为出发菌株，通过自杀型质粒pUCTSR和同源重组技术实现基因缺失。其中，疮痂病链霉菌87.22菌株为目前已公开、且为公众所得的菌株，由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供，保藏编号为CGMCC 4.1765。
[0012]作为本专利技术的优选方式之一，所述bldD基因缺失突变株减少thaxtomin A生物合成，用于减轻疮痂病。
[0013]作为本专利技术的优选方式之一，所述bldD基因过表达菌株，是以疮痂病链霉菌87.22为出发菌株，将载体pKC
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bldD导入原始菌株中，获得过表达菌株。
[0014]作为本专利技术的优选方式之一，所述bldD基因过表达菌株用于高产thaxtomin A，用作除草剂。
[0015]本专利技术相比现有技术的优点在于：
[0016]本专利技术通过自杀型质粒pUCTSR和同源重组技术在疮痂病链霉菌中对转录调控基因bldD进行缺失，从而获得thaxtomin A生物合成发生改变的基因缺失突变株，为研究的疮痂病链霉菌次级代谢物thaxtomin A生物合成提供技术支持。其中，当疮痂病链霉菌87.22中敲除bldD基因时，ΔbldD突变菌株中次级代谢物thaxtomin A产量大幅度下降；而在ΔbldD突变菌株中回补bldD基因时，thaxtomin A的产量则得到了恢复；由此表明，疮痂病链霉菌BldD是一个参与thaxtomin A生物合成正调控因子。同时，在疮痂病链霉菌87.22中利用高拷贝质粒pKC1139对bldD基因进行过量表达，thaxtomin A的产量提高。这些说明bldD基因的缺失和过量表达可以用来定向的改变疮痂病链霉菌中thaxtomin A的生物合成产量。
附图说明
[0017]图1是bldD以及邻近基因在染色体上的位置信息；
[0018]图2是利用自杀型质粒pUCTSR和同源重组技术构建缺失突变株的示意图；
[0019]图3是ΔbldD缺失突变株菌液PCR验证示意图(图中，用硫链丝菌素抗性基因tsr替换疮痂病链霉菌染色体上bldD基因，bldD基因303bp被tsr基因1360bp替换之后，阳性克隆的PCR扩增条带为1558bp；M，5000bp DNA Marker)；
[0020]图4是原始菌株87.22和ΔbldD相关菌株发酵产物中thaxtomin A产量的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过疮痂病链霉菌中转录因子基因bldD改变thaxtomin A生物合成的方法，其特征在于，通过基因工程途径对疮痂病链霉菌中的转录因子基因bldD进行缺失或/过表达，从而获得bldD基因缺失突变株/bldD基因过表达菌株，利用所得菌株生产thaxtomin A；其中，bldD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的通过疮痂病链霉菌中转录因子基因bldD改变thaxtomin A生物合成的方法，其特征在于，所述bldD基因的基因产物正向调控thaxtomin A的生物合成。3.根据权利要求1所述的通过疮痂病链霉菌中转录因子基因bldD改变thaxtomin A生物合成的方法，其特征在于，所述bldD基因缺失突变株，是以疮痂病链霉菌8...

【专利技术属性】
技术研发人员：董胜男，刘静，杨恩东，张部昌，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：