一种生产（R,R）-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种生产(R,R)

【技术实现步骤摘要】
一种生产(R,R)
‑
2,3
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丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株及应用


[0001]本专利技术涉及一种生产(R,R)
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2,3
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丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株及应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]2，3
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丁二醇(2,3
‑
BD)是一种重要的平台化合物，在食品、化工、制药、能源领域具有广泛的应用价值，微生物发酵生产是现代生物化工的重要方向。2,3
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丁二醇分子中含有两个手性碳原子，因此存在三种光学异构体，分别是(2R,3R)
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2，3
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丁二醇、(2S,3S)
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2,3
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丁二醇和meso
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2,3
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丁二醇。单一构型的(R,R)
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2,3
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丁二醇除了具有混合构型2,3
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丁二醇的功能外，还是合成手性试剂和手性配体的重要前体，在高价值手性液晶材料、农药和医药中间体非对称合成方面具有特殊应用。传统化学合成法获得的2,3
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丁二醇是三种光学异构体的混合物，不但存在过程繁琐、产率低、污染环境等问题，而且由于不同立体构型2,3
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丁二醇的物理化学性质相近，手性拆分成本十分高昂，难以实现大规模低成本生产。因此，微生物方法合成单一构型的(R,R)
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2,3
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丁二醇具有重要研究意义。
[0003]乙偶姻通常情况下作为食品添加剂，增加食品的香气，是一种天然的食品添加剂；在医药行业，乙偶姻由于具有不同的构型可以用来合成稀有药物及作为药物中间体，另外，乙偶姻在烟草、塑料工业、化学工业及涂料工业都有广泛的应用，乙偶姻作为一种重要的四碳平台化合物，被美国能源部列为优先进行工艺开发利用的30种平台化合物之一。
[0004]四甲基吡嗪(TTMP)，俗称川芎嗪，是植物川芎中的一种活性生物碱，同时还是一种医药和农药行业中间体，被用来合成多种用途广泛的药物，其本身也具有临床药理作用，在治疗心脑血管疾病、抗癌、抗自由基方面有显著的效果，被广泛的应用于临床治疗。此外，四甲基吡嗪还是一种天然存在的香气物质，天然存在可可豆、咖啡、花生等坚果类物质、豆类制品和肉类等物质中，具有烘烤香气，被食品加工行业广泛采用。
[0005]2,3
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丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪作为天然的食品添加剂，可以添加到白酒中用于调节白酒风味，提升白酒品质。随着石油产品的日益耗尽，微生物发酵法可以以廉价的原料生产2,3
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丁二醇和乙偶姻及四甲基吡嗪，并且生物发酵法对环境的污染较小，符合绿色化工的要求，因此，人们越来越重视微生物发酵法生产(R,R)
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2,3
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丁二醇、乙偶姻及四甲基吡嗪。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种生产(R,R)
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2,3
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丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株及应用，本专利技术通过构建双高效启动子表达载体，并连接(R,R)
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2,3
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丁二醇脱氢酶的编码基因bdhA(Gene ID:939490)，再导入到枯草芽孢杆菌BS1(来源：齐鲁工业大学生物工程学部微生物酶技术实验室)中，以此来过表达(R,R)
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2，3
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丁二醇脱氢酶(BDH)，获得能够生产(R,R)
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2，3
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丁二醇和乙偶姻的基因工程菌株，同时还通过代谢工程技术对代谢网络
进行优化，优化生产培养基及发酵条件，提高(R,R)
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2,3
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丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的产量和转化率。
[0007]本专利技术生产(R,R)
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2,3
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丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株MW
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BS1，该菌株的保藏编号为CCTCC No：2022436，保藏日期为2022年04月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国、武汉、武汉大学，命名为Bacillus subtilis MW
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BS1。
[0008]进一步，本专利技术获得的基因重组工程菌株MW
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BS1在制备(R,R)
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2,3
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丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪中的应用。
[0009]更进一步的，所述基因重组工程菌株MW
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BS1分别生产(R,R)
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2,3
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丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的发酵条件如下：
[0010]温度35℃
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38℃，优选为37℃，pH 6.2
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6.7，优选为6.5，接种量为10％，v/v，通气量为1L/min，200r/min条件下恒温培养，发酵期间从第12h开始加入无菌葡萄糖溶液，然后每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵周期为3天，生产(R,R)
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2,3
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丁二醇；
[0011]温度35℃
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38℃，优选为37℃，pH 7.2
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7.8，优选为7.5，接种量为10％，v/v，通气量为1.5L/min，400r/min条件下恒温培养，发酵期间从第12h开始加入无菌葡萄糖溶液，然后每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵周期为5天，生产乙偶姻；
[0012]温度35℃
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38℃，优选为37℃，pH 7.2
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7.8，优选为7.5，接种量10％，v/v，通气量为1.5L/min，400r/min条件下恒温培养，发酵期间从第12h开始加入无菌葡萄糖溶液，然后每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵至第120h，添加25g/L(NH4)2HPO4，发酵温度升至42℃，发酵周期为10天，生产四甲基吡嗪。
[0013]本专利技术还包括通过上述发酵获得的(R,R)
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2,3
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丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪。
[0014]本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
[0015]在枯草芽孢杆菌中，(R,R)
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2,3
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丁二醇脱氢酶可以催化其代谢途径中的乙偶姻向(R,R)
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2,3
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丁二醇转化，并且(R,R)
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2,3
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丁二醇脱氢酶是一种双向催化酶，在不同的条件下可实现两种物质的互相转化，而乙偶姻又是四甲基吡嗪的前体物质，在枯草芽孢杆菌细胞内，乙偶姻可与铵根离子一系列反应生成四甲基吡嗪。专利技术人在枯草芽孢杆菌BS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产(R,R)
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2,3
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丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株，其特征在于，所述基因重组工程菌株MW
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BS1，该菌株的保藏编号为CCTCCNo：2022436，保藏日期为2022年04月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国、武汉、武汉大学，命名为Bacillus subtilis MW
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BS1。2.如权利要求1所述基因重组工程菌株在制备(R,R)
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2,3
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丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪中的应用。3.根据权利要求1所述基因重组工程菌株，其特征在于，所述基因重组工程菌株生产(R,R)
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2,3
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丁二醇的发酵条件如下：温度35℃
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38℃，pH 6.2
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6.7，接种量为10％，v/v，通气量为1L/min，200r/min条件下恒温培养，发酵期间从第12h开始加入无菌葡萄糖溶液，然后每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵周期为3天，生产(R,R)
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2,3
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丁二醇。4.根据权利要求3所述基因重组工程菌株，其特征在于，发酵温度为37℃，pH为6.5。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟武，石林，林源，秦伟帅，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：