一种铁限制条件下显著提高HSAF产量的菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种铁限制条件下显著提高HSAF产量的菌株及其应用，所述基因工程菌为将产酶溶杆菌(L.enzymogenes)OH11敲除或沉默编码铁响应转录因子Fur基因后获得，所述Fur基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。与野生型菌株相比，突变菌株在缺铁或者低铁的培养基中生长没有显著差异，而HSAF合成能力得到大大提高。突变菌株在缺铁培养基中，HSAF产量达到162.34

【技术实现步骤摘要】
一种铁限制条件下显著提高HSAF产量的菌株及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种铁限制条件下显著提高HSAF产量的菌株及其应用。
[0002]背景
[0003]溶杆菌属由Christensen和Cook在1978年建立分类，属于变形菌门(Proteobacteria)、γ
‑
变形菌纲(Gammaproteobacteria)、黄单胞目(Xanthomonadales)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)，是一种革兰氏阴性细菌，广泛存在于各种自然环境中。其对多种植物病原真菌、细菌、线虫等具有良好的防治作用，是新型生物农药开发的重要资源。截至目前为止，国内外报道的溶杆菌种类达到五十多种。
[0004]产酶溶杆菌是溶杆菌属的模式种，通过降解自然环境中的微生物和有机物获取能量来源，属于腐生型细菌。产酶溶杆菌OH11由本实验室2006年从辣椒根际土壤中分离到的具有自主知识产权的新型生防菌株，不仅能够产生蛋白酶、几丁质酶、β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶、纤维素酶，而且还能产生多种抗菌小分子化合物，特别是热稳定抗真菌因子(Heat Stable Antifungal Factor,HSAF)，在其生防机理中发挥了主要的作用。与其他抗真菌物质相比，HSAF具有两大优势。一是抑菌机制新颖，对哺乳动物、昆虫、鱼类和植物等无毒无害；二是对热、酸和碱性条件稳定性高，有利于产业化和过程的提取、运输和、储存和使用。近20年来，本团队已系统开展了HSAF结构鉴定、合成途径、遗传调控、产量提升以及抗菌机理等方面的工作。然而，对于生防细菌来说，如何在自然环境中定殖并最大限度地发挥生防活性，是目前生防产品创制研究的一个重要难题。
[0005]铁是绝大多数细菌生存所必需的营养物质，参与了许多重要的生物学过程，如电子传递、呼吸作用、DNA合成、三羧酸循环等。尽管铁是地壳中第四大元素，但自然界中的铁大多以氧化态或氢氧化态的形式存在而溶解度极低，游离的铁非常少。因此在缺铁或者限铁环境中提高生防菌株生长代谢能力对于发挥生防活性至关重要。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术一种铁限制条件下显著提高HSAF产量的菌株及其应用。
[0007]本专利技术的目的之一提供一株基因工程菌OH11
‑
ΔFur，所述基因工程菌为将产酶溶杆菌(L.enzymogenes)OH11敲除或沉默编码铁响应转录因子Fur基因后获得，所述Fur基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术基因敲除或沉默的方法可以按照本领域的常规方法，在本专利技术的一些实施例中，采用的是构建敲除载体pEX18Gm
‑
Fur然后利用同源重组双交换方法获得敲除菌株，更具体的例如本实验室专利CN102943061A中公开的电转化及突变体筛选方法。
[0009]在本专利技术的一种具体的实施例中，包括如下步骤：
[0010](1)敲除载体的构建
[0011]设计目的基因Fur上游臂引物和下游臂引物，PCR扩增获得上下游同源臂各600bp
左右基因片段，利用无缝克隆的方法将Fur同源臂与自杀质粒pEX18Gm连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a，经电泳验证、测序正确后，命名为pEX18Gm
‑
Fur，于
‑
20℃条件下保存备用。所述的自杀质粒pEX18Gm利用Hind III/Xba I内切酶进行双酶切。
[0012](2)突变菌株的获得
[0013]将上述重组载体pEX18Gm
‑
Fur通过电转化转入野生型产酶溶杆菌OH11感受态细胞内，涂布于含庆大霉素抗性的LB固体平板上进行一次交换子筛选，挑取单菌落于LB液体中培养7
‑
9h进行二次交换，取100μL涂布于质量分数10
‑
15％蔗糖的LB固体平板上，挑取二次交换子同时划线于庆大霉素抗性的LB平板和无抗性LB平板上，28℃培养3
‑
4天；对在无抗性LB平板上生长，而在庆大霉素抗性LB平板不生长的交换子进行菌液PCR验证，从而获得基因敲除突变体，命名为OH11
‑
ΔFur。
[0014]所述基因敲除方法中涉及的分子操作未特别说明的，均为本领域常规方法。
[0015]作为改进的，筛选二次交换子中质量分数10
‑
15％蔗糖的LB固体平板需要添加FeCl
3 10
‑
50mg/L，优选20
‑
30mg/L。
[0016]本专利技术的第二个目的是提供所述基因工程菌OH11
‑
Δfur在生产抗真菌活性物质HSAF中的应用。特别是在缺铁或者限铁环境中生产抗真菌活性物质HSAF中的应用。
[0017]在一些实施例中，本专利技术所述的应用的具体方法是利用基因工程菌OH11
‑
Δfur进行发酵培养，在一些具体的实例中发酵过程为：将突变体OH11
‑
ΔFur接入到LB液体培养基中26～28℃、170～190rpm培养12
‑
15h，按照1.0
‑
2.5％接种量转入发酵培养基中，26
‑
28℃、150
‑
200rpm培养48
‑
60h，提取发酵液中抗真菌活性物质HSAF，利用HPLC进行检测。
[0018]在一些实施例中，本专利技术所述的发酵培养基成分为：葡萄糖5
‑
15g/L、(NH4)2SO
4 0.5
‑
2.0g/L、FeCl
3 0
‑
32mg/L、MgCl
2 5
‑
20mg/L、K2HPO
4 0.5
‑
4.0g/L、KH2PO
4 0.25
‑
2.0g/L，CaCO
3 0.25
‑
1.5g/L。优选的所述的发酵培养基成分为：葡萄糖5
‑
10g/L、(NH4)2SO
4 0.8
‑
1.2g/L、FeCl
3 0
‑
8mg/L、MgCl
2 8
‑
15mg/L、K2HPO41.0
‑
1.5g/L、KH2PO
4 0.5
‑
0.75g/L，CaCO
3 0.5
‑
1.0g/L。更优选的所述的发酵培养基成分为：葡萄糖8g/L、(NH4)2SO
4 1.0g/L、MgCl
2 10mg/L、K2HPO
4 1.0g/L、KH2PO
4 0.5g/L，CaCO
3 1.0g/L。所述的发酵培养基均用去离子水配制。
[0019]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株基因工程菌OH11
‑
ΔFur，其特征在于，所述基因工程菌为将产酶溶杆菌(L.enzymogenes)OH11敲除或沉默编码铁响应转录因子Fur基因后获得，所述Fur基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的基因工程菌OH11
‑
ΔFur，其特征在于，基因敲除采用的是构建敲除载体pEX18Gm
‑
Fur然后利用同源重组双交换方法获得敲除菌株。3.权利要求1或2所述的基因工程菌OH11
‑
Δfur在生产抗真菌活性物质HSAF中的应用。4.权利要求1或2所述的基因工程菌OH11
‑
Δfur在缺铁或者限铁环境中生产抗真菌活性物质HSAF中的应用。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，是利用基因工程菌OH11
‑
Δfur进行发酵培养；优选的，是将突变体OH11
‑
ΔFur接入到LB液体培养基中26～28℃、170～190rpm培养12
‑
15h，按照1.0
‑
2.5％接种量转入发酵培养基中，26
‑
28℃、150
‑
200rpm培养48
‑
60h，提取发酵液中抗真菌活性物质HSAF。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基成分为：葡萄糖5
‑
15g/L、(NH4)2SO
4 0.5
‑
2.0g/L、FeCl
3 0
‑
32mg/L、MgCl
2 5
‑
20mg/L、K2HPO
4 0.5
‑
4...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤宝，刘凤权，王波，徐志周，侯荣鲜，张敏，陈贤，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：