本发明专利技术涉及一种高分子γ－聚谷氨酸的生产方法。采用的技术方案是：纳豆菌接种于活化培养基中活化；活化的菌种接入装有２００ｍｌ培养基的５００ｍｌ三角瓶中，在３７℃、２００转／分钟转速下，培养２４小时；培养好的种子液按１００００ｃｆｕ／ｍｌ的比例接种到３．５Ｌ发酵培养液中进行发酵罐培养；在３５～３８℃，１５０～２５０转／分钟转速，通气量１．０ＶＶＭ下，调节罐压０．０５～０．１ＭＰａ，培养３０～４０小时后，补料１．０～１．７Ｌ，继续培养４０～５０小时；发酵完毕，经提取工艺得到产物γ－聚谷氨酸。所制得的γ－聚合谷氨酸的分子量达３００以上，产率高，在食品、化妆品、医药品等的开发领域具有良好的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物发酵生产天然高分子产物的领域，具体地涉及一 种高分子量的Y -聚谷氨酸的生产方法。
技术介绍
在资源短缺与环境污染日趋严重的当今社会，进行"绿色化学产 品"的开发已成为世界化工产业的新趋向。顺应于这一发展趋势与社 会需求，Y-聚谷氨酸(Poly glutamicacid， ^ .^.4)成为了目前国内 外正在兴起且广受生产者与消费者注目的新型"绿色生物高分子材 料"之一。Y-聚谷氨酸是由D-谷氨酸或L-谷氨酸的？羧基与氨基通过酰胺 键连接聚合而成的氨基酸化合物。作为一种水溶性的生物高分子材料， y-PGA具有良好的生物可降解性和生物相容性，并且具有可食、对人 体和环境无毒害、吸水性与保湿性强等优异特性，在化妆品、农业、 医药和食品等领域具有广阔的应用潜力。关于y-PGA的制造方法，近年来国内外主要以枯草芽孢杆菌来发 酵生产。例如Kubota曾从土壤中成功的分离得到一株产y-PGA的菌株 5ac/〃船sw6"/^ F201 (Biosci. Biotech. Biochem.， 61， 1684-1687, 1997)。 Ogawa等利用万a"7/w w^'fc MR 141生产？PGA，产量达35g/L(Biotechnol Lett, 22, 585-588， 2002)。李木目桦等对5a"7/M "c/zem/c^mz; ATCC9945a采用补加糖高密度培养的方法，使，PGA的产量达到55g/L (专利号，00819560.9)。但这些菌都是谷氨酸底物依存菌，生产时需添 加谷氨酸作为营养原料，因此，原料成本相对较高。近年来，我国有 研究报道经过诱变选育的非谷氨酸底物依赖菌(万""7/1^^&/&)在适 当的培养条件下y-PGA产量达18 30g/L,有望成为生产用菌株(施庆珊 等，专利号200610122640.5;疏秀林等，专利号200810027184.5)。但目前生产上所用的这些菌株均没有在食品工业上应用的实例。也就是说，这些产品在食品、医药品与化妆品等的直接应用于人体上的安全 性方面还有待进一步的考证。同时其发酵原料的成本与生产效率也有 待于进一步的改善。到目前为止，在众多的y-PGA的产生菌中，纳豆菌(^c/〃w 是人类唯一具有长年的食用经验的菌种，其对人体的安全 性是无容置疑的。同时，由纳豆菌生产的"PGA的分子量一般在300 万以上，远远的高于其他菌种生产的y-PGA的分子量(分子量一般在 100万以下)，这也意味着由纳豆菌生产的y-PGA具有更强的粘性以及 更高的吸收与保水性能。但是，用纳豆菌生产y-PGA时，由于固体发 酵难以实现规模化的生产，而液体发酵中由于其高粘性所带来的供氧 的难度以及发酵体系中y-PGA分解酶的存在对，PGA产生的裂解作 用，使得y-PGA在大量生产中存在着产量的不稳定性等问题。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种Y-聚谷氨酸的生产方法。通 过市售的纳豆菌及一般公认的培养基为原料，通过营养枯竭和环境压 力的胁迫作用来得到高产量的，PGA。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是 一种高分子Y-聚 谷氨酸的生产方法，工艺步骤如下1) 菌种的活化将纳豆菌，接种于活化培养基中，活化培养基的组成为葡萄糖5-20g/L，蛋白冻5-20g/L，酵母粉5-20g/L，氯化钠1-5 g/L，琼脂15-20g/L;于35 38。C，培养40 55小时；2) 种子培养经活化的菌种接入装有200ml培养基的500ml三角 瓶中，在35 38。C、 150 250转/分钟的转速下，培养20 24小时， 培养基组成为葡萄糖5-20g/L，蛋白冻5-20g/L，酵母粉5-20g/L，氯 化钠1-5 g/L;3) 发酵培养将培养好的种子液按10000 cfiz/ml的比例接种到3.5 L发酵培养液中进行发酵罐培养；发酵培养液组成为葡萄糖5-20 g/L， 玉米淀粉5-20 g/L，大豆蛋白5-20 g/L，氯化钠1-5 g/L，碳酸钙0.05-0.4g/L，硫酸镁0.05-0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5-2.0 g/L;培养温度35 38。C， 搅拌速度150 250转/分钟，通气量1.0 VVM，调节罐压0.05 0.1 MPa 下，培养30 40小时后，补料1.0 1.7L，继续培养40 50小时；4)发酵完毕，经提取工艺得到产物Y-聚谷氨酸。提取工艺按照常规的回收方法，发酵液经除菌、有机溶剂(低级 醇)沉淀回收、透析等过程精制后冻结干燥，得到产物y-PGA。产物 经GPC分析(色谱柱ZorbaxGF-250，流动相0.1 M磷酸钠缓冲液) 分子量300万以上。所述的纳豆菌可以是市售的商业性菌种，也可以是以这些菌株为 出发菌，通过常规的化学或生物技术的手段诱导而得的菌种。本专利技术的有益效果是本专利技术采用廉价易得的原料，通过外界环 境胁迫的方法提高了 y-PGA的产率，抑制了 Y-PGA的分解，增加了 Y-PGA生产的稳定性与大分子量的高粘度特性。采用本专利技术的方法， ，PGA产率可达到31.8g/L。由于采用的纳豆菌是人类唯一具有长年的 食用经验的菌种，因此其产品在食品、医药品与化妆品等的直接应用 上，具有安全性，可直接应用于此领域产品的生产之中。具体实施例方式实施例l1、 菌种的选择将市购的纳豆菌，经平板稀释培养后，选择拉丝 丰富、抗拉伸力强的菌落，进行分离。2、 菌种的活化将分离得到的纳豆菌，接种于活化培养基中，活化培养基的组成为葡萄糖13g/L，蛋白冻13g/L，酵母粉13g/L，氯 化钠3g/L，琼脂18g/L;于37'C，培养48小时；3、 种子培养经活化的菌种一环接入装有200ml培养基的500ml 的三角瓶中，在37-C、 200转/分钟的转速下，培养24小时，培养基组 成为葡萄糖13g/L，蛋白冻13g/L，酵母粉13g/L，氯化钠3g/L;4、 发酵培养将上述培养好的种子液按10000 cfb/ml的比例接种 到3.5L发酵培养液中进行发酵罐培养；发酵培养液组成为葡萄糖13g/L，玉米淀粉13 g/L，大豆蛋白13 g/L,氯化钠3 g/L,碳酸钙0.27g/L， 硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L;培养温度37"C,搅拌速度200转 /分钟，通气量1.0WM，调节罐压0.08MPa，培养36小时后，pH急 剧上升、营养出现枯竭时，补料1.5L，继续培养48小时；5、 Y-聚谷氨酸的回收发酵完毕，按照常规的提取工艺(Vardet al.， Biotechnology and Bioengineering, 41, 1963)回收？PGA:发酵液 经离心除菌、乙醇沉淀回收后，将沉淀物溶解于蒸馏水中、再次用乙 醇沉淀回收，此操作重复3—4次后将沉淀物溶解于水，流水中透析24 小时后，冷冻干燥即得Y-PGA产品，产率31.8g/L。此产品用1.0N的盐酸IO(TC分解24小时后，用薄层层析检测到其 分解产物为谷氨酸，说明所得到的产物为目的产物Y-PGA。所用展开 液为正丁醇/冰醋酸/水=4/1/3，发色剂为茚三酮。此y-PGA产品经液 相色谱分析(色谱柱ZorbaxGF-250，流动相0.1 M磷酸钠缓冲本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高分子γ－聚谷氨酸的生产方法，其特征在于包括如下步骤： １）菌种的活化：将纳豆菌，接种于活化培养基中，活化培养基的组成为：葡萄糖５－２０ｇ／Ｌ，蛋白冻５－２０ｇ／Ｌ，酵母粉５－２０ｇ／Ｌ，氯化钠１－５ｇ／Ｌ，琼脂１５－２０ｇ／Ｌ； 于３５～３８℃，培养４０～５５小时； ２）种子培养：经活化的菌种接入装有２００ｍｌ培养基的５００ｍｌ三角瓶中，在３５～３８℃、１５０～２５０转／分钟的转速下，培养２０～２４小时，培养基组成为：葡萄糖５－２０ｇ／Ｌ，蛋白冻５－２０ｇ／Ｌ ，酵母粉５－２０ｇ／Ｌ，氯化钠１－５ｇ／Ｌ； ３）发酵培养：将培养好的种子液按１００００ｃｆｕ／ｍｌ的比例接种到３．５Ｌ发酵培养液中进行发酵罐培养；发酵培养液组成为：葡萄糖５－２０ｇ／Ｌ，玉米淀粉５－２０ｇ／Ｌ，大豆蛋白５－２０ｇ／Ｌ ，氯化钠１－５ｇ／Ｌ，碳酸钙０．０５－０．４ｇ／Ｌ，硫酸镁０．０５－０．５ｇ／Ｌ，磷酸二氢钾０．５－２．０ｇ／Ｌ；培养温度３５～３８℃，搅拌速度１５０～２５０转／分钟，通气量１．０ＶＶＭ，调节罐压０．０５～０．１ＭＰａ下，培养３０～４０小时后，补料１．０～１．７Ｌ，继续培养４０～５０小时； ４）发酵完毕，经提取工艺得到产物γ－聚谷氨酸。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李拖平，李苏红，
申请(专利权)人：李拖平，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]
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