用于细胞生长的试剂或组合物制造技术

本发明专利技术涉及用于细胞生长的试剂或组合物。本发明专利技术以DEPDC1蛋白为靶标制备并获得了特异性针对DEPDC1的单克隆抗体，该抗体经过检测与多种物质均不发生交叉反应表现出了较好的特异性，同时将该单克隆抗体与癌细胞共培养后发现能够抑制DEPDC1的表达同时还能够抑制癌细胞的增殖。胞的增殖。

【技术实现步骤摘要】
用于细胞生长的试剂或组合物


[0001]本申请涉及生物领域，具体的涉及用于细胞生长的试剂或组合物。

技术介绍

[0002]胰腺癌恶性程度高，起病隐匿，早期诊断困难。早期胰腺癌以手术为首选治疗方式，但易复发。进展期胰腺癌对放疗不敏感，只能进行以化疗为主的全身综合治疗。吉西他滨是目前标准胰腺癌化疗的一线治疗药物，但治疗效果不能满足临床需求，新型靶向治疗药物是研究热点。迈人21世纪后，肿瘤的治疗业已进入了分子靶向治疗的时代。所谓分子靶向药物就是主要针对肿瘤发生、发展过程中的关键大分子，包括参与肿瘤发生发展过程中的细胞信号传导和其他生物学途径的靶点(参与肿瘤细胞分化、周期调控、凋亡、浸润和转移等过程中，从DNA至蛋白、酶水平的任何亚细胞分子)；通过特异性阻断肿瘤细胞的信号转导，来控制其基因表达和改变生物学行为，或是通过强力阻止肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤细胞的生长和增殖，积极发挥抗肿瘤作用。因此，一般而言，分子靶向药物的选择性高，广谱有效，不易发生耐药，同时安全性优于细胞毒性化疗药物。
[0003]随着现代免疫学和分子生物学的迅猛进展，许多分子靶向治疗药物在单独或联合治疗已初步显示出抗胰腺癌作用。这些药物包括调控肿瘤细胞生长的化合物如Ftase抑制剂、抗血管形成的基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(如Ma
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rimastat)和血管内皮生长因子(VEFG)的单克隆抗体、表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂(IMC
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C225、Erlotinib、Gefitinib)、PS
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341以及反义RNA等，它们单用或联合GEM应用可能有效，目前正在成为新的研究热点。现有的分子靶向制剂目前针对胰腺癌治疗的分子靶向制剂主要为抑制表皮生长因子受体(EGFR)和抗血管内皮生长因子(VEGF)及其受体，EGFR靶向制剂主要包括西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)；VEGF和VEGFR靶向制剂主要包括贝伐单抗(bevacizumab)、单抗DC101、抑制剂ZD6474和SU5416。但是目前，可提供的治疗药物种类还不够丰富多样。
[0004]在经典Wnt/β
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catenin信号中，Wnt配体可以和Fz受体以及低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)形成蛋白复合体。Dvl作为支架蛋白是高度动态的，通过与Wnt
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Fz
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LRP6蛋白复合体不断聚合解聚，来调节信号的顺利发生。简单而言，Dvl蛋白能否顺利从细胞质结合到细胞膜上，对于Wnt/β
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catenin信号的顺利发生非常重要。通过多肽文库筛选，Dvl蛋白的DEP结构域和C端序列(DEP
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C区域)对于募集该蛋白到Fz上起到重要的作用。研究发现小鼠Dvl1的DEP结构域表面有数个氨基酸残基聚集在一起，使DEP结构域表面带正电荷。由于细胞膜内侧面的脂质带负电荷，通过静电吸引作用力，募集Dvl蛋白结合到Fz蛋白，但是这种相互作用对胞内pH值比较敏感，主要受质膜Na+/H+交换子Nhe2的影响。
[0005]DEPDC1是包含一个DEP结构域的癌蛋白，除在睾丸中表达外，在其他正常人体组织中被很难检测到。DEP结构域是在Dishevelld、EGL
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10和Pleckstrin3种蛋白中被发现的，因而以这3个蛋白质的首字母命名。癌蛋白DEPDC1的编码基因DEPDC1位于染色体1p31.2，长约23kb，由于选择性剪切，该基因的表达产物可形成分子量分别为93kD和61kD的两种亚型。由
于在除睾丸外的正常组织中尚未发现DEPDC1表达，因此对DEPDC1的功能研究大多是癌细胞中进行的。而目前对其作用机制的了解主要来自有关膀胱癌的实验研究，即DEPDC1与锌指蛋白224(ZNF224)形成复合物抑制锌指蛋白A20基因表达，减弱了A20对核因子κB抑制蛋白(I
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κB)降解的抑制作用，从而促进NF
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κB转位进入细胞核内激活相关基因表达，最终发挥抗凋亡生理作用。在癌细胞系HeLa、MCF7和SH
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SY5Y的实验表明，DEPDC1可以调控c
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Jun氨基末端激酶(JNK)的激活及抗凋亡蛋白髓细胞白血病基因
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1的降解，长春新碱就是通过这一途径发挥其诱导细胞凋亡的生理作用。
[0006]DEPDC1（DEPdomaincontaining1）已经被证实与多个肿瘤的发生密切相关，例如前列腺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌。并且在这些肿瘤中高度表达，并且与临床预后不良密切相关。以上的研究均表明，DEPDC1在大多数肿瘤中过表达，具有成为生物标志物和治疗靶点的潜力。DEPDC1在肺腺癌中过表达也被初步证实，有研究证实靶向DEPDC1会激活核因子κB（NF
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κB）信号通路介导肺腺癌细胞的凋亡。siRNA介导的DEPDC1缺失显著抑制了鼻咽癌细胞系CNE
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1和HNE
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1的增殖，但是目前，针对DEPDC1敲除在胰腺癌中的应用研究还不多，有待进一步的研究。

技术实现思路

[0007]本专利技术一方面，针对DEPDC1蛋白，开发了特异性的单克隆抗体。
[0008]进一步的，所述单克隆抗体为Ac06。
[0009]进一步的，所述的单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
[0010]进一步的，本专利技术的单克隆抗体还可以被修饰。
[0011]具体的，所述修饰为在氨基酸序列上进行一个或二个或三个或四个或五个或六个或七个或八个的氨基酸的取代，所述取代后，保持单抗的生物活性保持不变。
[0012]具体的，所述取代包括多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中“氨基酸取代”或“取代”意指亲本多肽序列中特定位点的氨基酸被另一种氨基酸替换。本文中，术语“保守的修饰”或“保守的序列修饰”意指不显著影响或改变含所述氨基酸序列的抗体结合特性的氨基酸修饰。所述保守的修饰包括氨基酸取代、插入和缺失。修饰可通过本领域公知的标准技术例如定点突变和PCR介导的突变引入本专利技术的抗体中。保守的氨基酸取代是其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族是本领域已定义的。所述家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链的氨基酸(例如苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本专利技术抗体的CDR区或框架区中的一个或多个氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DEPEC1特异性的单克隆抗体Ac06，所述的单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。2.一种特异性抑制DEPEC1蛋白活性的试剂，其特征在于所述试剂含有DEPEC1单克隆抗体Ac06，所述的单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。3.如权利要求2所述的试剂，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹兰，劳越，
申请(专利权)人：广州黎欧科技有限公司，
类型：发明
国别省市：