一种检测单ADP-核糖基转移酶活性的基因编码探针制造技术

本发明专利技术公开一种检测单ADP

【技术实现步骤摘要】
一种检测单ADP
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核糖基转移酶活性的基因编码探针


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测单ADP
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核糖基转移酶活性的基因编码探针。

技术介绍

[0002]PARP全称为poly
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ADP
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ribose polymerase，即多聚ADP核糖聚合酶，参与了包括DNA修复、基因组稳定性等在内的一系列细胞过程。该蛋白家族由17个成员组成，它们都包含一个约230个氨基酸的共同催化结构域。家族中有四个成员(PARP1、2、5a和5b)可催化聚ADP
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核糖(PAR)链合成，其余成员被称为monoPARP，除PARP13外，仅能够转移一个单ADP
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核糖(MAR)部分。monoPARP蛋白家族在与癌症、炎性疾病和神经退行性疾病发展相关的多种应激反应中起作用。但是目前已有的PARP酶活性检测方法中，尚需要一种能有效区别分多聚ADP
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核糖活性的单ADP
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核糖(MAR)活性检测方法，以及能在活体细胞内直接实现检测和跟踪。这类方法对深入研究monoPARP的生物学功能和筛选特异性抑制剂是至关重要的，为药物高通量筛选提供简单、快速且成本低的手段。

技术实现思路

[0003]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测单ADP
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核糖基转移酶活性的基因编码探针。
[0004]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：/>[0005]一种检测单ADP
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核糖基转移酶活性的基因编码探针的制备方法，包括以下步骤，其特征在于，获得PARP14的编码序列，基于PARP14的Macrodomain2结构域，将绿色荧光蛋白连接到PARP14的Macrodomain2的C末端，构建表达M2
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NeoGreen融合蛋白的质粒，并在N端设计标签，在大肠杆菌中表达并纯化该M2
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NeoGreen融合蛋白。
[0006]进一步的，所述纯化为镍柱亲和层析纯化。
[0007]一种探针，包括PARP14的Macrodomain2结构域、以及绿色荧光蛋白。
[0008]进一步的，所述绿色荧光蛋白位于PARP14的Macrodomain2的C末端。
[0009]一种检测单ADP
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核糖基转移酶活性的基因编码探针的使用方法，包括以下步骤：获得TIPARP编码序列，在293T细胞中瞬时转染了含TIPARP表达元件的质粒后，使用PAR/MAR抗体以及M2
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NeoGreen融合蛋白的质粒分别对固定后的细胞进行染色。
[0010]进一步的，获得TIPARP编码序列，将融合了红色荧光蛋白的TIPARP真核表达质粒与M2
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NeonGreen融合蛋白一起对细胞进行共转染。
[0011]所述探针在药物高通量筛选中的应用。
[0012]所述探针在单ADP
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核糖基转移酶活性上的应用。
[0013]本专利技术的有益效果：
[0014]本专利技术通过一系列的实验，证明了M2
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NeoGreen探针在检测单ADP
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核糖基转移酶活性方法的可行性。M2
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NeonGreen探针不仅为细胞水平的药物高通量筛选提供了一种简
单、快速、低成本的方法，而且能为未来体内检测MAR信号提供了一种方便有效的工具。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0016]图1是M2
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NeonGreen重组蛋白的细胞水平染色；
[0017]图2是过表达TIPARP的活细胞中MARylation的可视化。
具体实施方式
[0018]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0019]一种检测单ADP
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核糖基转移酶活性的基因编码探针，
[0020]从GenBank数据库中获得TIPARP(NM_001184717.1)和PARP14(NM
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017554)的编码序列。基于PARP14的M2结构域，将绿色荧光蛋白(NeoGreen)连接到PARP14的Macrodomain2(M2)的C末端，构建了表达M2
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NeoGreen融合蛋白的质粒，在大肠杆菌中表达并纯化了该融合蛋白。在293T细胞中瞬时转染了含TIPARP表达元件的质粒后，使用PAR/MAR抗体以及M2
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NeoGreen融合蛋白分别对固定后的细胞进行染色。
[0021]由于细胞高表达TIPARP后，会出现大量单ADP核糖基化(MAR)的产物，并聚集在细胞核中，这就为活细胞内直接检测单ADP核糖基化(MAR)的活性提供了可能。我们将融合了红色荧光蛋白(jRGECO1α)的TIPARP真核表达质粒和编码M2
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NeonGreen探针的真核表达质粒共转染到293T细胞中。48h后，直接在显微镜下观察细胞，对两组转染细胞中的核凝聚物数量进行统计。结果表明，只有用TIPARP
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jRGECO1α和M2
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NeoGreen共转染的细胞才出现绿色的核凝聚物，
[0022]实施例1：基于PARP14的Macrodomain2的单ADP
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核糖基化活性的体外检测探针
[0023]原核表达载体的设计
[0024]先从GenBank数据库中获得TIPARP和PARP14的编码序列，分别用于构建TIPARP真核表达质粒以及PARP14的Macrodomain2结构域和NeonGreen的原核融合表达质粒(即用于原核表达M2
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NeonGreen探针的质粒)，并在N端设计6xHis标签(图1A)用于镍柱纯化。M2
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NeonGreen探针在大肠杆菌BL21DE3中表达，然后使用Ni
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NTA亲和层析纯化。
[0025]当通过SDS
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PAGE和考马斯蓝染色分析时，融合蛋白出现在预期的分子量处。使用LB培养基的产率约为15mg/L，纯度在90％以上。接下来，我们在293T细胞中瞬时转染TIPARP。结果表明，PAR/MAR抗体能够检测TIPARP过表达引起的ADP核糖基化(图1B)，而Rim抗体用于检测TIPARP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测单ADP
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核糖基转移酶活性的基因编码探针的制备方法，包括以下步骤，其特征在于，获得PARP14的编码序列，基于PARP14的Macrodomain2结构域，将绿色荧光蛋白连接到PARP14的Macrodomain2的C末端，构建表达M2
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NeoGreen融合蛋白的质粒，在载体细胞中表达并纯化该M2
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NeoGreen融合蛋白。2.根据权利要求1所述一种检测单ADP
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核糖基转移酶活性的基因编码探针的制备方法，其特征在于，所述纯化为镍柱亲和层析纯化。3.一种探针，包括PARP14的Macrodomain2结构域、以及绿色荧光蛋白。4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述绿色荧光蛋白位于PARP14的Macrodomain2的C末端。5.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晟，刘雪莲，赵志康，仲明，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：