本发明专利技术公开了一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，先采用前处理缓冲液对愈伤组织进行孵育，再用PBS缓冲液过渡后，采用MDC染色液进行染色，制备细胞悬液，观察。本发明专利技术通过前处理诱导增加细胞自噬水平，显著提高荧光染色强度，提高特异染色的自噬小体与背景的对比度，使细胞内自噬情况更容易被观察到；同时前处理缓冲液具有维持渗透压、保持液体环境pH稳定以及提供基本营养的作用，能显著提高染色的稳定性。本发明专利技术使用PBS缓冲液洗涤可以避免染色过度，降低背景杂乱程度。本发明专利技术染色步骤更加简洁，染色层次分明，细胞对比度清晰，使植物体细胞胚胎发生过程中的自噬现象高效可视化。体细胞胚胎发生过程中的自噬现象高效可视化。体细胞胚胎发生过程中的自噬现象高效可视化。
【技术实现步骤摘要】
一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术
[0001]本专利技术涉及一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，属于生物染色领域。
技术介绍
[0002]在营养缺乏或应激条件下，真核生物通过自噬途径将细胞内失活的蛋白质、受损伤的细胞结构和细胞器等实现循环再利用。自噬是真核生物细胞内重要的物质循环利用途径，该过程首先是将回收的物质包裹于膜内，继而运输到溶酶体、液泡中进行降解，或是被分泌到胞外，为细胞的重建、再生和修复提供必需原料。自噬诱发的关键环节是自噬小体的形成，典型的自噬小体是由膜(大部分表现为双层膜，有时会有多层或单层膜)包裹部分胞质、需降解的细胞器(如线粒体、内质网、核糖体)、蛋白质等形成封闭、圆球形的结构，直径约为0.5～1.5μm。在过去数十年里，基于自噬小体的形态发生来检测自噬过程的研究取得了重大进展，已在多种生物诸如酵母、果蝇、老鼠、人类体内观察到了自噬小体的超微结构。有趣的是，近年研究发现植物体细胞胚胎发生过程中也存在复杂的自噬现象，但由于愈伤细胞高度液泡化、结构松散且容易破碎等特点，使植物体细胞胚胎发生过程中的自噬活性检测相对困难。
[0003]丹酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC)作为一种嗜酸性染色剂，可通过离子捕获(ion trapping)及其与膜脂的特异性结合，从而特异性标记自噬小体(autophagosome)。正是由于这一特性，MDC通常被用于自噬小体检测的指示剂，其检测激发滤光片波长355～380nm，阻断滤光片波长512～530nm。传统方法先使用雷帕霉素(Rapamycin)或氯喹(Chloroquine)进行饥饿处理诱导自噬，再用蒸馏水稀释MDC母液制备工作液，对细胞进行染色。但存在诱导成本高、染色液寿命短、对环境敏感，染色结果不稳定，不易捕捉荧光染色结果等缺陷。
技术实现思路
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术。与传统的MDC染色法相比较，本专利技术有以下优点：通过前处理诱导增加细胞自噬水平，显著提高荧光染色强度，提高特异染色的自噬小体与背景的对比度，使细胞内自噬情况更容易被观察到；同时前处理缓冲液具有维持渗透压、保持液体环境pH稳定以及提供基本营养的作用，能显著提高染色的稳定性；染色液配制方便，染色步骤简洁，染色后荧光淬灭缓慢，便于观察拍照。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，包括以下步骤：
[0006](1)取同一时期的待检测愈伤组织样品，洗涤，然后加入前处理缓冲液浸没样品，孵育诱导细胞自噬发生；
[0007](2)弃去前处理缓冲液，加入PBS缓冲液，过渡；
[0008](3)弃去PBS缓冲液，加入MDC染色液浸没样品，染色；
[0009](4)弃去MDC染色液，洗涤；再加入PBS缓冲液，吹打分散，得到愈伤细胞悬液；
NaHCO3、2.02mM NaH2PO4、11.12mM D
‑
Glucose(D
‑
葡萄糖)，溶剂为蒸馏水。
[0031]MDC染色液的配制方法为：取适量MDC母液(1000X)，按照1:1000的体积比用PBS缓冲液稀释，得到MDC染色液(1X)。
[0032]实施例1：一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术
[0033](1)取同一时期的待检测棉花愈伤组织块样品(约0.05g)放入试管中，用PBS缓冲液洗涤1次，然后加入2mL前处理缓冲液浸没样品，在细胞培养箱中37℃孵育30min诱导细胞自噬发生；
[0034](2)弃去前处理缓冲液，每管加入2mL PBS缓冲液浸没样品，在细胞培养箱中37℃过渡10min；
[0035](3)弃去PBS缓冲液，每管加入1mL MDC染色液浸没样品，在细胞培养箱中37℃避光染色，染色时间可以根据实际染色效果在30～60min范围内适当调整；
[0036](4)弃去MDC染色液，使用PBS缓冲液洗涤3次，每次使用2mL PBS缓冲液；弃去PBS缓冲液，最后再加入1mL PBS缓冲液，轻柔吹打分散，得到愈伤细胞悬液；
[0037](5)将一滴细胞悬液涂在载玻片上，用盖玻片覆盖，除去多余的PBS缓冲液，并将制备好的细胞临时装片放在荧光显微镜操作台上，在显微镜下用355～380nm激发光激发，观察绿色荧光，分析细胞自噬活性。
[0038]实施例2：一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术
[0039](1)取同一时期的待检测棉花愈伤组织块样品(约0.05g)放入试管中，用PBS缓冲液洗涤1次，然后加入2mL前处理缓冲液浸没样品，在细胞培养箱中37℃孵育45min诱导细胞自噬发生；
[0040](2)弃去前处理缓冲液，每管加入2mL PBS缓冲液浸没样品，在细胞培养箱中37℃过渡10min；
[0041](3)弃去PBS缓冲液，每管加入1mL MDC染色液浸没样品，在细胞培养箱中37℃避光染色，染色时间可以根据实际染色效果在30～60min范围内适当调整；
[0042](4)弃去MDC染色液，使用PBS缓冲液洗涤3次，每次使用2mL PBS缓冲液；弃去PBS缓冲液，最后再加入1mL PBS缓冲液，轻柔吹打分散，得到愈伤细胞悬液；
[0043](5)将一滴细胞悬液涂在载玻片上，用盖玻片覆盖，除去多余的PBS缓冲液，并将制备好的细胞临时装片放在荧光显微镜操作台上，在显微镜下用355～380nm激发光激发，观察绿色荧光，分析细胞自噬活性。
[0044]实施例3：一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术
[0045](1)取同一时期的待检测棉花愈伤组织块样品(约0.05g)放入试管中，用PBS缓冲液洗涤1次，然后加入2mL前处理缓冲液浸没样品，在细胞培养箱中37℃孵育60min诱导细胞自噬发生；
[0046](2)弃去前处理缓冲液，每管加入2mL PBS缓冲液浸没样品，在细胞培养箱中37℃过渡10min；
[0047](3)弃去PBS缓冲液，每管加入1mL MDC染色液浸没样品，在细胞培养箱中37℃避光染色，染色时间可以根据实际染色效果在30～60min范围内适当调整；
[0048](4)弃去MDC染色液，使用PBS缓冲液洗涤3次，每次使用2mL PBS缓冲液；弃去PBS缓冲液，最后再加入1mL PBS缓冲液，轻柔吹打分散，得到愈伤细胞悬液；
[0049](5)将一滴细胞悬液涂在载玻片上，用盖玻片覆盖，除去多余的PBS缓冲液，并将制备好的细胞临时装片放在荧光显微镜操作台上，在显微镜下用355～380nm激发光激发，观察绿色荧光，分析细胞自噬活性。
[0050]对比例1：一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术
[0051]本对比例方法与实施例3基本相同，不同的是用蒸馏水代替前处理缓冲液。
[0052]对比例2：一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术
[0053]本对比例方法与实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，其特征在于，包括以下步骤：(1)取同一时期的待检测愈伤组织样品，洗涤，然后加入前处理缓冲液浸没样品，孵育诱导细胞自噬发生；(2)弃去前处理缓冲液，加入PBS缓冲液，过渡；(3)弃去PBS缓冲液，加入MDC染色液浸没样品，染色；(4)弃去MDC染色液，洗涤；再加入PBS缓冲液，吹打分散，得到愈伤细胞悬液；(5)制作愈伤细胞临时装片，利用荧光显微镜观察绿色荧光，分析愈伤细胞自噬活性。2.根据权利要求1所述的棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，其特征在于，每升PBS缓冲液的配制方法为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800mL蒸馏水中，用HCl溶液调节pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。3.根据权利要求1所述的棉花愈伤细胞自噬活性可视化检测技术，其特征在于，前处理缓冲液包括以下浓度的组分：234.48mM NaCl、1...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁佳辰，刘醒醒，葛晓阳，王少龙，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：
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