荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法技术

本发明专利技术适用于神经科学领域，提供了荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法，包括：步骤一、采用Pulsineli的四血管闭塞法制作大鼠短暂性全脑缺血模型，对模型动物进行取样处理，保证标本在实验过程中的稳定性；步骤二、对步骤一中所获取的标本进行单色荧光染色，随后将切片内Rhodamine R6荧光标记转换成3,3'

【技术实现步骤摘要】
荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法


[0001]本专利技术属于神经科学领域，尤其涉及荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法。

技术介绍

[0002]神经元死亡是多种急慢性神经退行性疾病如脑缺血、缺氧和癫痫等的主要病理特征之一。神经元死亡可视化技术不仅能够定性和（或）定量分析神经元死亡发生发展过程，而且还能用于评价动物模型是否成功或神经保护药物或措施是否有效。
[0003]到目前为止，形态学特征依然是区分濒死或死亡细胞的主要标准之一，因此光学显微镜和电子显微技术在研究神经元死亡时发挥着重要的作用。光学显微镜检测神经元死亡耗时较少、费用较低，因此比电子显微镜更为便捷实用；然而只有电子显微镜才能观察到神经元死亡的超微细节，因此电子显微镜技术的重要性迄今为止依然无可替代。常用神经元死亡检测的组化技术包括苏木精
‑
伊红（H
‑
E）染色、尼氏（Nissl）染色、酸性品红（Acid fuchsin）染色、Fluoro
‑
Jade（FJ）染色和银（Silver）染色等，但是这些方法通常很难用于双重或多重染色，因此如果不参考阳性细胞形态学和位置特征，通常很难判断死亡细胞的种类。此外，这些技术所标记的阳性结构只能在光学显微镜下观察，无法用电子显微镜对光学染色结构进一步验证和研究。
[0004]Rhodamine R6是一种脂溶性罗丹明衍生物，广泛应用于荧光显微镜或流式细胞仪监测活细胞内线粒体膜电位（例如，Invitrogen
™ꢀ
R648MP）。这种染料很少用于动物体内实验中，到目前为止尚无报道它们是否可以用于神经元死亡的超微形态学检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术实施例的目的在于提供荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法，旨在解决神经元死亡常规组织化学检测技术难以同时用于荧光和电子显微镜观察的难题。Rhodamine R6是一种脂溶性罗丹明衍生物，广泛应用于荧光显微镜或流式细胞仪监测活细胞内线粒体膜电位（例如，Invitrogen
™ꢀ
R648MP）。这种染料很少用于动物体内实验中，到目前为止尚无报道它们是否可以用于神经元死亡的超微形态学检测。
[0006]本专利技术实施例是这样实现的，首先对切片标本进行单色荧光染色，随后将切片内Rhodamine R6荧光标记转换成3,3'
‑
二氨基联苯胺沉淀，并将切片制作成电镜标本，并对实验结果进行测定。
[0007]所述荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法包括如下步骤：步骤一、采用Pulsineli的四血管闭塞法制作大鼠短暂性全脑缺血模型，对模型动物进行取样处理，保证标本在实验过程中的稳定性；步骤二、对步骤一中所获取的标本进行单色荧光染色，随后将切片内Rhodamine R6荧光标记转换成3,3'
‑
二氨基联苯胺沉淀，并将切片制作成电镜标本，并对实验结果进行测定。
[0008]作为本专利技术更进一步的方案，步骤一中所述的采用Pulsineli的四血管闭塞法制作大鼠全脑缺血模型和取样处理包括如下步骤：S1、取10%的水合氯醛按照0.4ml/100g的比例对大鼠进行腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧固定，用酒精棉擦拭大鼠颈部正中皮肤并修剪鼠毛，用碘伏消毒；S2、在大鼠颈部正中处剪开2cm的小口，并沿胸锁乳突肌内侧缘将胸锁乳突肌向外侧拨开，分离颈总动脉周围筋膜，并游离出一段血管穿线备用，再用同样的方法处理对侧动脉，完成后缝合皮肤，并用碘伏擦拭消毒；S3、将大鼠俯卧固定，用S1中所述方法进行消毒处理后，在颈后部正中剪开1cm的小口，用钝性镊子从中间分开椎旁肌，显露第一颈椎椎板，再向外上方游离，暴露左右两侧的翼小孔；S4、将电凝器插入翼小孔进行电凝，电凝结束后缝合肌肉和皮肤，用碘伏擦拭消毒，将其放回笼中；S5、等待24h，取出大鼠，仰卧固定，用S2中所述的方法暴露两侧颈总动脉，用动脉夹夹闭，随后解除固定，大鼠翻正反射和角膜反射于15
‑
30s消失证明全脑缺血成功，中途出现抽搐者舍弃不用；S6、双侧颈总动脉夹闭13min后，去除动脉夹使血流恢复；然后缝合皮肤，用碘伏擦拭消毒，放回笼中继续饲养。
[0009]S7、在缺血再灌注后1~14天，用10%的水合氯醛对实验动物进行腹腔麻醉，打开胸腔暴露心脏，通过灌流泵经升主动脉，先用生理盐水冲洗血液，随后改为4%多聚甲醛经进行灌流固定；S8、灌流后取出动物的大脑放入4%多聚甲醛4~6h，随后将脑组织放入5%蔗糖内保存；S9、采用振动切片机将脑组织切成30~50μm厚度的切片，用0.1M磷酸缓冲液洗3次，每次5~15分钟，置于4℃冰箱存放。
[0010]作为本专利技术更进一步的方案，步骤二中所述的荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法包括如下步骤：S1、将切片收集到24孔板内，浸泡在浓度为0.5~3%的过氧化氢溶液中，在摇床上反应10~30min；S2、加入浓度为0.06~0.25%、pH为4.5~7.5的高锰酸钾水溶液，对切片进行预处理5~15分钟，高锰酸钾预处理可以显著降低染色背景，省略该步骤对实验结果无明显影响；S3、对预处理后的切片先用蒸馏水短暂清洗，随后用0.1M的PB缓冲液清洗三次，每次5~10分钟；S4、加入Rhodamine R6工作液，并在室温下避光孵育5min~2h，阴性对照组用0.1M的磷酸缓冲液替代Rhodamine R6；S5、对孵育后的切片用0.1M的PB缓冲液清洗三次，每次5~10分钟；S6、部分切片按照FluoroJade B（FJ
‑
B）染色步骤进行染色以确认神经元死亡，部分切片用4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚染色以确认细胞核形态变化。染色完毕后，将切片捞到载玻片上，用荧光显微镜进行观察照相；S7、荧光显微镜观察后，将Rhodamine R6染色的切片重新放回24孔板内，置于含有
4~10%正常山羊血清和0.05~0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚的0.1M磷酸缓冲液中室温孵育0.5~1.0小时；S8、吸弃S7的溶液，加入小鼠单克隆抗罗丹明抗体，并置于4℃的环境下过夜反应；S9、将切片用0.1M磷酸缓冲液洗涤三次，加入山羊抗小鼠IgG H&L （Biotin）二抗，并在室温环境下孵育1~2小时；S10、将切片用0.1M磷酸缓冲液洗涤3次，每次5~15分钟，随后加入抗生物素
‑
生物素
‑
过氧化物酶复合物，在室温环境下反应0.5~1.5小时；S11、将反应后的切片用0.1M磷酸缓冲液洗涤3次，每次5~15分钟，再用50mM的pH为7.4的Tris缓冲液洗涤5~15分钟；S12、加入含有浓度为0.001~0.05%的3,3'
‑
二氨基联苯胺的50mM的Tris缓冲液，在室温环境下反应约5~15分钟；S13、加入含有0.005~0.03%的过氧化氢和浓度为0.001~0.05%的3,3'
‑
二氨基联苯胺的50mM本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法，其特征在于，所述荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法包括如下步骤：步骤一、采用Pulsineli的四血管闭塞法制作大鼠短暂性全脑缺血模型，对模型动物进行取样处理；步骤二、对步骤一中所获取的标本进行单色荧光染色，随后将切片内Rhodamine R6荧光标记转换成3,3'
‑
二氨基联苯胺沉淀，并将切片制作成电镜标本，并对实验结果进行测定。2.根据权利要求1所述的荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法，其特征在于，步骤一中所述的采用Pulsineli的四血管闭塞法制作大鼠全脑缺血模型，对模型动物进行取样处理包括如下步骤：S1、取10%的水合氯醛按照0.4ml/100g的比例对大鼠进行腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧固定，用酒精棉擦拭大鼠颈部正中皮肤并修剪鼠毛，用碘伏消毒；S2、在大鼠颈部正中处剪开2cm的小口，并沿胸锁乳突肌内侧缘将胸锁乳突肌向外侧拨开，分离颈总动脉周围筋膜，并游离出一段血管穿线备用，再用同样的方法处理对侧动脉，完成后缝合皮肤，并用碘伏擦拭消毒；S3、将大鼠俯卧固定，用S1中所述方法进行消毒处理后，在颈后部正中剪开1cm的小口，用钝性镊子从中间分开椎旁肌，显露第一颈椎椎板，再向外上方游离，暴露左右两侧的翼小孔；S4、将电凝器插入翼小孔进行电凝，电凝结束后缝合肌肉和皮肤，用碘伏擦拭消毒，将其放回笼中；S5、等待24h，取出大鼠，仰卧固定，用S2中所述的方法暴露两侧颈总动脉，用动脉夹夹闭，随后解除固定，大鼠翻正反射和角膜反射于15
‑
30s消失证明全脑缺血成功，中途出现抽搐者舍弃不用；S6、双侧颈总动脉夹闭13min后，去除动脉夹使血流恢复；然后缝合皮肤，用碘伏擦拭消毒，放回笼中继续饲养；S7、在缺血再灌注后1~14天，用10%的水合氯醛对实验动物进行腹腔麻醉，打开胸腔暴露心脏，通过灌流泵经升主动脉，先用生理盐水冲洗血液，随后改为4%多聚甲醛经进行灌流固定；S8、灌流后取出动物的大脑放入4%多聚甲醛4~6h，随后将脑组织放入5%蔗糖内保存；S9、采用振动切片机将脑组织切成30~50μm厚度的切片，用0.1M磷酸缓冲液洗3次，每次5~15分钟，置于4℃冰箱存放。3.根据权利要求1所述的荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法，其特征在于，步骤二中所述的荧光和电子显微镜术耦连检测神经元死亡的方法包括如下步骤：S1、将切片收集到24孔板内，浸泡在浓度为0.5~3%的过氧化氢溶液中，在摇床上反应10~30min；S2、加入浓度为0.06~0.25%、pH为4.5~7.5的高锰酸钾水溶液，对切片进行预处理5~15分钟；S3、对预处理后的切片先用蒸馏水短暂清洗，随后用0.1M的PB缓冲液清洗三次，每次5~10分钟；
S4、加入Rhodamine R6工作液，并在室温下避光孵育5min~2h，阴性对照组用0.1M的磷酸缓冲液替代Rhodamine R6；S5、对孵育后的切片用0.1M的PB缓冲液清洗三次，每次5~10分钟；S6、部分切片按照FluoroJade B（FJ
‑
B）染色步骤进行染色以确认神经元死亡，部分切片用4',6
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：谭百宏，李艳超，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：