基于HCR的检测沙门氏菌多价适配体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于HCR的检测沙门氏菌多价适配体的制备方法其应用，特点是包括以下步骤：1）将生物素化发夹DNA1、DNA2与生物素化沙门氏菌适配体分别经退火前处理；2）将触发链DNA与生物素化发夹DNA1、DNA2混合，在37℃下过夜反应，得到HCR骨架溶液，然后在HCR骨架溶液中加入生物素化沙门氏菌适配体反应得到检测沙门氏菌多价适配体溶液，其检测方法为将沙门氏菌待测溶液添加到高吸附酶标板上后，依次加入检测沙门氏菌多价适配体溶液、链酶亲和素化辣根过氧化物酶和3,3',5,5'

【技术实现步骤摘要】
基于HCR的检测沙门氏菌多价适配体的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种沙门氏菌的检测方法，尤其是涉及一种基于HCR的检测沙门氏菌多价适配体的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]沙门氏菌（Salmonella）是一种常见的食源性病原菌，尽管已经有完善的标准和立法体系来控制其对食品的污染，但是沙门氏菌仍然对人类健康有巨大威胁。因此，建立可靠、灵敏的检测方法对沙门氏菌进行检测是保障食品质量和安全的关键。
[0003]传统的细菌培养法是食源性致病菌检测的金标准方法，但其费时费力，不能满足快速检测的需求。在过去几十年，分子扩增技术（如聚合酶链式反应，PCR）和免疫学方法（酶联免疫吸附试验，ELISA），基于分子生物的检测方法灵敏度高，但其造成的气溶胶污染引起的假阳性是限制这些方法应用的主要原因。免疫学方法通常通过抗原
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抗体反应并通过酶催化反应放大检测信号，这种方法具有高特异性，而且能避开复杂的DNA提取和气溶胶污染的问题。然而，复杂的抗体制备工艺和脆弱的抗体活性使得这些方法有成本高、保质期短的缺陷。因此，迫切需要开发出一种简便、灵敏度高、特异性良好的方法用于食源性致病菌的检测。
[0004]适配体是从大量随机序列的核酸文库中选取的对靶标具有较高特异性的短单链DNA或RNA寡核苷酸。与抗体相比，适配体具有结构设计上的多功能性、合成成本低、重复性好、易修饰、稳定好等优点。因此，适配体被认为是能够替代抗体的识别元件，并在食源性病原菌的检测中发挥重要作用。然而，由于复杂的食品基质干扰，大多数适配体的亲和力降低，这限制了适配体的实际应用。为了弥补亲和力的降低导致的低灵敏度，基于适配体的检测方法大多采用信号放大策略、等温核酸扩增技术、酶级联扩增等。值得注意的是，可以通过适配体变构探针结合RNA扩增和CRISP
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Cas13a得到的三阶段扩增实现在不同样品中单个沙门氏菌的检测。然而，这些繁琐的纳米材料的制备和修饰以及复杂的级联放大设计限制了这些基于适配体的检测方法的应用。因此，迫切需要一种简单有效的信号放大策略或增强适配体亲和力的方法来提高基于适配体检测方法的灵敏度。杂交链式反应( HCR) 是一种无需酶参与,利用碱基互补配对进行交替杂交的信号放大技术。目前，国内外还没有公开关于HCR同时用于构建多价适配体与信号放大检测沙门氏菌的方法的相关研究报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强的基于HCR的检测沙门氏菌多价适配体的制备方法及其应用。
[0006]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于HCR的检测沙门氏菌多价适配体的制备方法，包括以下步骤：（1）将生物素化发夹DNA1、生物素化发夹DNA2与生物素化沙门氏菌适配体分别经退火前处理；
（2）将触发链DNA（trigger）与生物素化发夹DNA1、生物素化发夹DNA2混合，在37 ℃下过夜反应，得到HCR骨架溶液，然后在HCR骨架溶液中加入生物素化沙门氏菌适配体在37 ℃下反应2小时，得到检测沙门氏菌多价适配体溶液。
[0007]进一步，步骤（1）中所述的发夹DNA1的核苷酸序列如下：TTTCCCTTATATTCTCTCTCTCTCCTGCGGGAATGTCTAGGTGATTGAGTGGTGTGTTATCCCACTCAATCACCTAGACCATTCCGCAACAACATAC（划线部分为与适配体互补部分）；所述的发夹DNA2的核苷酸序列如下：GATAACACACCACTCAATCACCTAGACATTCCCGCAGTATGTTGTTGCGGAATGGTCTAGGTGATTGAGTGG；所述的沙门氏菌适配体的核苷酸序列如下：GAGAGAGAATATAAGGGAAAAAAAACTCCTCTGACTGTAACCACGGTGGTTTGATCACTATTGGGCCTTTGTGATGTCGGTAGT（划线部分为与发夹DNA1互补部分）。
[0008]进一步，步骤（1）中所述的退火前处理为95 ℃加热10分钟后立即插到冰上15分钟。
[0009]进一步，步骤（2）中所述的触发链DNA（trigger）的核苷酸序列如下：GTATGTTGTTGCGGAATGGTCTAGGTGATTGAGTGG。
[0010]进一步，步骤（2）具体为将0.5 μL 0.1 μM 触发链DNA（trigger）与0.5 μL 5 μM 生物素化发夹DNA1和0.5 μL 5 μM生物素化发夹DNA 2混合，并用磷酸盐缓冲液定容至2.5 μL，在37 ℃下反应过夜，得到HCR骨架；然后在HCR骨架溶液中加入0.6 μL 5 μM生物素化适配体，并用磷酸盐缓冲液定容至10 μL，在37 ℃下反应2小时，即得到检测沙门氏菌多价适配体溶液。以保证HCR骨架上的生物素化发夹DNA1和生物素化沙门氏菌适配体通过互补链充分结合。
[0011]上述制备方法得到的检测沙门氏菌多价适配体用于检测沙门氏菌的方法，具体步骤如下：将50 μL沙门氏菌待测溶液添加到高吸附酶标板上，孵育2小时后，加入1wt %的牛血清蛋白溶液孵育30分钟，随后加入50 μL浓度为0.05 μM的检测沙门氏菌多价适配体溶液，45分钟后弃去未结合的多价适配体，然后添加50 μL链酶亲和素化辣根过氧化物酶（SA
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HRP）孵育25分钟后，加入50 μL 3,3',5,5'
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四甲基联苯胺（TMB）显色液，经避光显色15分钟后用50 μL 2 M H2SO4终止反应，用酶标仪定量检测，根据检测不同浓度沙门氏菌对应的吸光度值得到的曲线，对待测溶液中沙门氏菌浓度进行定量检测。
[0012]进一步，所述的孵育温度为37 ℃，每一步孵育结束后均需用含0.01% 吐温
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20的磷酸盐缓冲液洗板三次。
[0013]专利技术原理：利用HCR产物为长双链DNA以及DNA的可编程性，在发夹DNA1 5
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端设计一段延伸序列与适配体（Apt）5
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端的延伸序列互补，通过简单的碱基互补配对将适配体连接到HCR骨架上得到高价态的多价适配体用于捕获沙门氏菌。为了检测信号的输出，在适配体（Apt）的5
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端修饰生物素，与链酶亲和素化辣根过氧化物酶（SA
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HRP）通过链酶亲和素
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生物素的结合方式结合，最后添加底物显色。与此同时，在两个发夹DNA的3
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端同时修饰上生物素，将此富含生物素的HCR作为信号载体（辣根过氧化物酶，HRP）的支架，以提高检测灵敏度。在检测时，首先将沙门氏菌吸附在高吸附酶标板上，经封闭后，加入多价适配体，由于其对沙门氏菌具有高亲和力，故会与沙门氏菌特异性结合。随后通过链酶亲和素
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生物素的结合方式使链酶亲和素化辣根过氧化物酶（SA
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HRP）与多价适配体上的生物素结合，最后添加底物显色。吸光度值与沙门氏菌浓度呈线性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于HCR的检测沙门氏菌多价适配体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将生物素化发夹DNA1、生物素化发夹DNA2与生物素化沙门氏菌适配体分别经退火前处理；（2）将触发链DNA与生物素化发夹DNA1、生物素化发夹DNA2混合，在37 ℃下过夜反应，得到HCR骨架溶液，然后在HCR骨架溶液中加入生物素化沙门氏菌适配体在37 ℃下反应2小时，得到检测沙门氏菌多价适配体溶液。2.根据权利要求1所述的基于HCR的检测沙门氏菌多价适配体的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的发夹DNA1的核苷酸序列如下：TTTCCCTTATATTCTCTCTCTCTCCTGCGGGAATGTCTAGGTGATTGAGTGGTGTGTTATCCCACTCAATCACCTAGACCATTCCGCAACAACATAC；所述的发夹DNA2的核苷酸序列如下：GATAACACACCACTCAATCACCTAGACATTCCCGCAGTATGTTGTTGCGGAATGGTCTAGGTGATTGAGTGG；所述的沙门氏菌适配体的核苷酸序列如下：GAGAGAGAATATAAGGGAAAAAAAACTCCTCTGACTGTAACCACGGTGGTTTGATCACTATTGGGCCTTTGTGATGTCGGTAGT。3.根据权利要求1所述的基于HCR的检测沙门氏菌多价适配体的制备方法，其特征在于，其特征在于：步骤（1）中所述的退火前处理为95 ℃加热10分钟后立即插到冰上15分钟。4.根据权利要求1所述的基于HCR的检测沙门氏菌多价适配体的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的触发链DNA的核苷酸序列如下：GTATGTTGTTGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔朝晖，孙梦妮，马娜，时含星，杨文鸽，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：