一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法，包括步骤：根据靶标序列设计Cas12a蛋白的crRNA；根据靶标序列设计用于扩增的正向引物和反向引物；将缓冲液与正向引物、反向引物和Cas12a蛋白、crRNA进行混合，得到反应体系；向反应体系中加入待测样品，然后在预定温度下反应预定时间，实现富集低丰度单核苷酸变异体。特别地，当在反应体系中加入荧光检测DNA单链探针(reporter)时，利用Cas12a的反式切割活性切割探针产生荧光信号，可以初步判定样本的SNV丰度。本发明专利技术利用反应体系包括RPA反应体系和CRISPR/Cas12a反应体系的特点，通过重组酶聚合酶扩增与CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法。

技术介绍

[0002]人体中单核苷酸变异体(Single Nucleotide Variants，SNVs)已作为诸如药物耐药性、癌症诊断、传染病等的检测标志物。目前现有技术中，测序是检测SNV的金标准。然而，单核苷酸变异体不仅绝对数量极少，而且通常受到大量野生型核酸(Wild
‑
Type，WT)的严重干扰。因此，对于低于1％的样本测序无法准确检测。因而发展出富集SNV的相关技术以使其达到测序标准。
[0003]传统的对于单核苷酸变异体的富集技术分为两类；其一是捕获富集技术，其二是以PCR扩增技术为基础的富集技术。但捕获富集技术在捕获洗脱的过程会造成核酸的损失，且捕获的SNV不足以达到测序标准时仍然需要扩增。而以PCR扩增技术为基础的富集技术用特异性引物不仅设计和筛选难度高，而且会导致扩增效率差，且在一定程度上WT仍会被扩增。除此之外，这些技术所需的精密温度控制还需要大型昂贵仪器支持。
[0004]CRISPR/Cas系统具有单核苷酸分辨能力，Cas蛋白与其向导crRNA结合，通过crRNA与靶标序列碱基互补配对进而激发Cas蛋白的顺式切割活性，将靶标序列从中间切断。因为WT和SNV具有单碱基的差异，所以二者会造成Cas蛋白切割速率不同，在此时通过恒温扩增技术将未切断的序列进行扩增则达到富集的目的。
[0005]Chen等人通过将RPA扩增技术与Cas9结合实现了富集SNV的目的，但Cas9蛋白脱靶效应较高，种子区域较短，且其向导RNA长达100nt，成本较高。
[0006]因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现思路

[0007]鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法，旨在解决现有对单核苷酸变异体的测序不能准确检测到低于1％SNV样本的问题。
[0008]本专利技术的技术方案如下：
[0009]一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法，包括步骤：
[0010]根据靶标序列设计Cas12a蛋白的crRNA；
[0011]根据靶标序列设计用于扩增的正向引物和反向引物；
[0012]将缓冲液与所述正向引物、所述反向引物和所述Cas12a蛋白、所述crRNA进行混合，得到反应体系；
[0013]向所述反应体系中加入待测样品，然后在预定温度下反应预定时间，实现富集低丰度单核苷酸变异体。
[0014]所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其中，所述crRNA是所述Cas12a蛋白的
向导RNA，所述向导RNA包括通用序列和间隔序列。
[0015]所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其中，所述通用序列自主形成发卡结构，与所述Cas12a蛋白特异性识别；所述间隔序列与待测样品中的野生型DNA完全互补，所述间隔序列与待测样品中的单核苷酸变异体存在错配。
[0016]所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其中，所述通用序列为5
’‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU
‑3’
，所述间隔序列为连接在所述通用序列3
’
端的至少18个碱基X；其中，每个所述碱基X独立选自A、G、C或T中的一种。
[0017]所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其中，所述反应体系包括RPA反应体系和CRISPR
‑
Cas12a反应体系；所述RPA反应体系包括所述正向引物、所述反向引物、重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、缓冲液；所述CRISPR
‑
Cas12a反应体系包括所述Cas12a蛋白、所述crRNA。
[0018]所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其中，所述预定温度为37
‑
42℃；所述预定时间为大于20分钟。
[0019]所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其中，所述待测样品中含有野生型DNA和单核苷酸变异体。
[0020]所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其中，向所述反应体系中加入荧光检测DNA单链探针，利用所述Cas12a蛋白的反式切割活性切割所述荧光检测DNA单链探针产生荧光信号，对所述待测样品的SNV丰度进行初步判定；
[0021]所述荧光检测DNA单链探针两端分别修饰有荧光基团和猝灭基团。。
[0022]所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其中，所述Cas12a蛋白包括LbCas12a、FnCas12a、AsCas12a中的一种或多种；所述Cas12a蛋白通过重组表达或蛋白纯化的方式获得。
[0023]所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其中，所述待测样品选自细菌、组织、体液中的一种。
[0024]有益效果：本专利技术提供一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法，包括步骤：根据靶标序列设计Cas12a蛋白的crRNA；根据靶标序列设计用于扩增的正向引物和反向引物；将缓冲液与所述正向引物、所述反向引物和所述Cas12a蛋白、所述crRNA进行混合，得到反应体系；向所述反应体系中加入待测样品，然后在预定温度下反应预定时间，实现富集低丰度单核苷酸变异体。特别地，当在反应体系中加入荧光检测DNA单链探针(reporter)时，利用Cas12a的反式切割活性切割探针产生荧光信号，可以初步判定待测样品的SNV丰度。本专利技术利用反应体系包括RPA反应体系和CRISPR/Cas12a反应体系的特点，通过重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)与CRISPR
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Cas12a在一管中对低丰度样品的竞争反应，实现富集SNV的目的，检测限可达0.01％。
附图说明
[0025]图1为本专利技术富集低丰度单核苷酸变异体的方法的原理图；
[0026]图2为本专利技术实施例1反应体系中优化Cas12a
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crRNA浓度的凝胶电泳图；
[0027]图3为本专利技术实施例2富集FLT3 F691L样品的数据图；
[0028]图4中的(A
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B)为本专利技术实施例3富集FLT3 F691L样品的反式切割数据图；
[0029]图5为本专利技术实施例4富集EGFR L858R样品的数据图；
[0030]图6中的(A
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B)为本专利技术实施例5富集无PAM的EGFR L858R样品的数据图；
[0031]图7为本专利技术实施例6富集BRCA1
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3232A＞G样品的数据图。
具体实施方式
[0032]本专利技术提供一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0033]本
技术人员可以理解，除非本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其特征在于，包括步骤：根据靶标序列设计Cas12a蛋白的crRNA；根据靶标序列设计用于扩增的正向引物和反向引物；将缓冲液与所述正向引物、所述反向引物和所述Cas12a蛋白、所述crRNA进行混合，得到反应体系；向所述反应体系中加入待测样品，然后在预定温度下反应预定时间，实现富集低丰度单核苷酸变异体。2.根据权利要求1所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其特征在于，所述crRNA是所述Cas12a蛋白的向导RNA，所述向导RNA包括通用序列和间隔序列。3.根据权利要求2所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其特征在于，所述通用序列自主形成发卡结构；所述间隔序列与待测样品中的野生型DNA完全互补，所述间隔序列与待测样品中的单核苷酸变异体存在错配。4.根据权利要求2所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其特征在于，所述通用序列为5
’‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU
‑3’
，所述间隔序列为连接在所述通用序列3
’
端的至少18个碱基X；其中，每个所述碱基X独立选自A、G、C或T中的一种。5.根据权利要求1所述的富集低丰度单核苷酸变异体的方法，其特征在于，所述反应体系包括RPA反应体系和CRISPR

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翼振，陈勇，赵屹，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：