一种冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术涉及冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及其应用，可有效解决内参基因的筛选和验证的问题，其解决的技术方案是，所述的冬凌草实时荧光定量PCR内参基因中，GADPH、18S和eIF是最为稳定的3个内参基因；在不同胁迫处理下，UBQ、HIS和PP2A是盐胁迫和脱水胁迫下最为稳定的3个内参基因；UBQ、eIF和PP2A是水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸处理下最为稳定的3个内参基因，本发明专利技术通过对盆栽的冬凌草进行了不同组织以及不同胁迫处理，筛选出了扩增效率高、稳定性好的冬凌草内参基因，是冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选及其应用上的创新。新。新。

【技术实现步骤摘要】
一种冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及其应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程技术，特别是一种冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及其应用。

技术介绍

[0002]冬凌草为唇形科香茶菜属植物碎米桠(Isodon rubescens(Hemsl.)Hara)的干燥地上部分，主产于我国河南济源太行山一带，为河南济源地区道地药材。1977年，冬凌草被收入《中华人民共和国药典》，并编入《全国中草药汇编》，其味苦、甘，微寒；具有清热解毒、活血止痛等多种功效，用于咽喉肿痛，癥瘕痞块，蛇虫咬伤。
[0003]冬凌草含有萜类、黄酮类、生物碱等多种活性成分，其中主要活性成分为冬凌草甲素(Oridonin)和冬凌草乙素(Ponicidin)等。现代药理学实验研究表明冬凌草甲素对乳腺癌、食管癌、喉癌、结肠癌等多种癌症有显著疗效，可作为抗肿瘤药。因此，冬凌草作为一种药理活性良好、肝肾毒性较低的抗肿瘤植物，已成为研究其药理功效的重要对象。随着分子生药学的发展和进步，冬凌草主要活性成分的生物合成和基因调控的功能研究越来越受到人们的重视。
[0004]实时荧光定量PCR(RT
‑
qPCR)是基因功能验证的重要方法，而RT
‑
qPCR技术需要有内参基因为参考，因此，其最重要的一个环节是内参基因的筛选和验证。然而，现有技术中还没有冬凌草内参引物的相关研究公开，这成为对冬凌草基因的功能验证和分子生物学研究的主要障碍。因此，筛选冬凌草不同条件下稳定表达的内参基因，是冬凌草基因功能研究的前提；有利于对冬凌草相关基因表达水平的研究结果可靠性提供技术支持。

技术实现思路

[0005]针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及其应用，可有效解决内参基因的筛选和验证的问题。
[0006]本专利技术解决的技术方案是，所述的冬凌草实时荧光定量PCR内参基因中，GADPH、18S和eIF是最为稳定的3个内参基因；在不同胁迫处理下，UBQ、HIS和PP2A是盐胁迫和脱水胁迫下最为稳定的3个内参基因；UBQ、eIF和PP2A是水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸处理下最为稳定的3个内参基因，所述的GADPH的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的18S的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的eIF的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的UBQ的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述的HIS的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述的PP2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0007]所述的内参基因GADPH扩增引物序列为：
[0008]F：5
’‑
GGCAAAGTTCTCCCTGCTCT
‑3’
；
[0009]R：5
’‑
CCCCTCAGACTCCTCCTTGA
‑3’
；
[0010]所述的内参基因18S的引物序列是：
[0011]F：5
’‑
ACCACATCCAAGGAAGGCAG
‑3’
；
[0012]R：5
’‑
TCTTCATCGATGCGAGAGCC
‑3’
；
[0013]所述的内参基因eIF的引物序列是：
[0014]F：5
’‑
ATGTGCCTCATGTGAACCGT
‑3’
；
[0015]R：5
’‑
CTGCACAGACACGACGAGAT
‑3’
；
[0016]所述的内参基因UBQ的引物序列是：
[0017]F：5
’‑
CTGAGGCTTCGTGGAGGGAT
‑3’
；
[0018]R：5
’‑
TGTAGTCTGCAAGAGTCCTT
‑3’
；
[0019]所述的内参基因HIS的引物序列是：
[0020]F：5
’‑
ACGATCGTGCGCATTAGGAG
‑3’
；
[0021]R：5
’‑
CTTACGGGCAGTTTGCTTGG
‑3’
；
[0022]所述的内参基因PP2A的引物序列是：
[0023]F：5
’‑
TGGTGACCGTTTTCAGTGCT
‑3’
；
[0024]R：5
’‑
TAGTGTCGGGCTCAATCTGC
‑3’
。
[0025]所述的冬凌草实时荧光定量PCR内参基因在冬凌草荧光定量PCR检测中的应用。
[0026]所述的冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的扩增引物在冬凌草荧光定量PCR检测中的应用。
[0027]本专利技术冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，具体包括以下步骤：
[0028]步骤1，材料的获取：选取在光照培养箱生长6个月的冬凌草植株进行实验处理和采样，植物组织包括根、茎、叶和花，脱水胁迫为将冬凌草植株从土中取出洗净根系的土壤，吸干水分后，置于实验室台面进行自然脱水，分别于0h、2h、4h和8h进行取样；盐胁迫为浇灌200mM NaCl；水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)处理分别为200μmol SA、200μmol MeJA、300μmol ABA喷施整个植株叶片，至叶片滴水，以上处理均为处理后的0h、4h、8h和12h进行取样；所取样本均为植株的第4～8的节点间的叶片，所取样品均立即放入冻存管中，不同样本重复采集三次，将采集后的样本装袋编号，用液氮速冻后，放入
‑
80℃超低温冰箱中保存，备用；
[0029]步骤2，冬凌草不同样本RNA提取及cDNA模板准备：将采集保存的样品在液氮中分别研磨成细粉，使用北京艾德莱公司的EASYspin Plus Plant RNA Kit提取试剂盒分别提取不同样品的总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000spectrophotometer检测RNA质量，
‑
80℃冰箱中保存备用，进一步使用全式金公司的All
‑
in
‑
One First
‑
Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒进行冬凌草不同样品总RNA反转录，将得到的反转录产物置于
‑
20℃的冰箱中保存；
[0030]步骤3，候选内参基因选取，并设计合成PCR扩增引物：根据冬凌草转录组测序技术获得冬凌草中相对稳定表达的内参候选基因的核苷酸序列，以拟南芥的内参序列为参考，经过序列分析以及与NCBI数据库Blast比对，确定12个基因序列为冬凌草内参候选基因的序列，随后又基于此序列设计本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种冬凌草实时荧光定量PCR内参基因，其特征在于，冬凌草不同组织的荧光定量PCR内参基因中，GADPH、18S 和 eIF 是最为稳定的3个内参基因；在不同胁迫处理下，UBQ、HIS和PP2A是盐胁迫和脱水胁迫下最为稳定的3个内参基因；UBQ、eIF和PP2A是水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸处理下最为稳定的3个内参基因，所述的GADPH的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的18S的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的eIF的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的UBQ的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述的HIS的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述的PP2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。2.权利要求1所述的冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的扩增引物，其特征在于，所述的内参基因GADPH扩增引物序列为：F：5
’‑
GGCAAAGTTCTCCCTGCTCT
‑3’
；R：5
’‑
CCCCTCAGACTCCTCCTTGA
‑3’
；所述的内参基因18S的引物序列是：F：5
’‑
ACCACATCCAAGGAAGGCAG
‑3’
；R：5
’‑
TCTTCATCGATGCGAGAGCC
‑3’
；所述的内参基因eIF的引物序列是：F：5
’‑
ATGTGCCTCATGTGAACCGT
‑3’
；R：5
’‑
CTGCACAGACACGACGAGAT
‑3’
；所述的内参基因UBQ的引物序列是：F：5
’‑
CTGAGGCTTCGTGGAGGGAT
‑3’
；R：5
’‑
TGTAGTCTGCAAGAGTCCTT
‑3’
；所述的内参基因HIS的引物序列是：F：5
’‑
ACGATCGTGCGCATTAGGAG
‑3’
；R：5
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CTTACGGGCAGTTTGCTTGG
‑3’
；所述的内参基因PP2A的引物序列是：F：5
’‑
TGGTGACCGTTTTCAGTGCT
‑3’
；R：5
’‑
TAGTGTCGGGCTCAATCTGC
‑3’
。3.权利要求1所述的冬凌草实时荧光定量PCR内参基因在冬凌草荧光定量PCR检测中的应用。4.权利要求2所述的冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的扩增引物在冬凌草荧光定量PCR检测中的应用。5.权利要求1所述的冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1，材料的获取：选取在光照培养箱生长6个月的冬凌草植株进行实验处理和采样，植物组织包括根、茎、叶和花，脱水胁迫为将冬凌草植株从土中取出洗净根系的土壤，吸干水分后，置于实验室台面进行自然脱水，...

【专利技术属性】
技术研发人员：练从龙，陈随清，张宝，兰金旭，杨晶凡，杨灏，郭凯华，李晶晶，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：