一种快速检测深部感染曲霉菌的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种快速检测深部感染曲霉菌的方法及试剂盒，将待测样本与核酸直裂提取液混合后于60～65℃加热8～20min，再于93～98℃加热5～10min，获得待测样本的DNA提取液，将所述DNA提取液加入含有深部感染曲霉菌的组合物的PCR预混液中，制得PCR反应液，将所述PCR反应液进行以下PCR扩增反应：控制温度在90～100℃时，进行变性，停留时间为0～5s，控制温度在50～70℃时，进行退火延伸，停留时间为0～5s，循环35～50次，该方法不仅提供了能够区分黄曲霉、黑曲霉和烟曲霉的特异性引物探针组合物，还可实现待测样本从核酸提取到核酸扩增反应等一系列过程的快速检测，节约检测时间。节约检测时间。节约检测时间。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测深部感染曲霉菌的方法及试剂盒


[0001]本专利技术是一种快速检测深部感染曲霉菌的方法及试剂盒，具体涉及一种能够快速实现深部感染曲霉菌（烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉）PCR核酸检测的方法及试剂盒，属于生物检测


技术介绍

[0002]侵袭性肺曲霉病（IPA）是指曲霉菌菌丝生长侵入肺实质而引起的感染性疾病，主要发生于免疫受损人群，如广谱抗生素、器官移植、肿瘤化疗等患者，占侵袭性曲霉菌感染的50%～60%。曲霉菌为条件致病菌，引起人类感染约有20种，以黄曲霉、黑曲霉和烟曲霉等最为常见。IPA早期诊断困难，且病情易被原发病掩盖，造成误诊、漏诊而延误治疗，未经及时治疗肺部曲霉菌感染患者的病死率可高达30%～80%。因此，正确及时诊断肺部曲霉菌感染的检测手段是临床上迫切需要解决的问题，开发一种更为敏感、特异的IPA早期诊断方法已迫在眉睫。
[0003]目前，常见的深度曲霉菌检测方法有病理组织学检查、影像学检测、培养、特异性抗原的测定和分子诊断技术，其中无菌部位组织镜检和血培养可以为确诊IPA提供直接证据；病理组织诊断的准确性与病灶部位、标本前处理方法以及诊断医师的经验有关，且存在耗时长、费用较高等问题；曲霉菌培养是目前诊断侵袭性曲霉菌感染的金标准，但其阳性检出率不高，且检测时间过长，不利于早期诊断；影像学诊断方法主要有X线、CT、MRI等，但影像学特征不具有特异性，也可见于其他病原菌感染。因此，本领域亟需一种速度快、灵敏度高、特异性好的检测曲霉菌的产品，从而节约检测时间，提升检测效率。
[0004]公布号为CN108070675A的专利技术专利提供了一种能够同时检测烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的特异性引物探针组合，由该引物探针组合制备的试剂盒的反应程序为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，57℃30s，40个循环。该专利重点考察了其特异性引物探针组合针对烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的特异性，灵敏度，稳定性，以及其与其他菌是否存在交叉反应，但该特异性引物探针组合并不能实现烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉在种水平上的区分，也不涉及对PCR反应过程中快速扩增的考察和研究。烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉均属于真菌的一种，真菌由于其细胞壁较厚（厚于绝大多数植物）、结构复杂、代谢产物多样，其DNA提取一直是真菌核酸检测的难点；对于核酸的快速扩增，目前有部分文献报道利用非常规的快速PCR仪，如光加热、热水加热、空气加热的PCR仪器结合导热效率高的金属耗材、厚度小于0.1mm的特定耗材实现了核酸的快速扩增，但是在现有商业化PCR仪器上，如何通过优化PCR体系和扩增条件实现核酸的快速扩增，其相关研究还鲜有报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在解决深部感染曲霉菌检测时如何快速提升检测效率及节约检测时间的方法，并为此提供了一种快速检测深部感染曲霉菌的方法，该方法可实现待测样本从核酸提取到核酸扩增反应等一系列过程的快速检测，同时还提供了能够区分黄曲霉、黑曲霉
和烟曲霉的特异性引物探针组合物。基于该快速检测体系，本专利技术还提供了一种快速检测深部感染曲霉菌的试剂盒。
[0006]本专利技术通过下述技术方案实现：一种快速检测深部感染曲霉菌的方法，将待测样本与核酸直裂提取液混合后于60～65℃加热8～20min，再于93～98℃加热5～10min，获得待测样本的DNA提取液，将所述DNA提取液加入含有深部感染曲霉菌的组合物的PCR预混液中，制得PCR反应液，将所述PCR反应液进行以下PCR扩增反应：控制温度在90～100℃时，进行变性，停留时间为0～5s，控制温度在50～70℃时，进行退火延伸，停留时间为0～5s，循环35～50次，所述核酸直裂提取液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、十二烷基磺酸钠以及蛋白酶；所述PCR预混液还包括脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、扩增缓冲液以及PCR增强剂中的至少一种；所述深部感染曲霉菌的组合物包括以下组分：如SEQ ID NO:1所示的黄曲霉上游引物、如SEQ ID NO:2所示的黄曲霉下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的黄曲霉探针；如SEQ ID NO:4所示的黑曲霉上游引物、如SEQ ID NO:5所示的黑曲霉下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的黑曲霉探针；以及如SEQ ID NO:7所示的烟曲霉上游引物、如SEQ ID NO:8所示的烟曲霉下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的烟曲霉探针。
[0007]进一步的，所述深部感染曲霉菌的组合物还包括：如SEQ ID NO:10所示的内标上游引物；如SEQ ID NO:11所示的内标下游引物；以及如SEQ ID NO:12所示的内标探针。
[0008]所述深部感染曲霉菌的组合物中引物的用量为100～1000nM；所述深部感染曲霉菌的组合物中探针的用量为50～800nM。
[0009]所述PCR增强剂包括甜菜碱、DMSO以及甘油。
[0010]本专利技术的另一技术方案是：一种快速检测深部感染曲霉菌的试剂盒，包括所述的核酸直裂提取液和PCR预混液，并按所述方法进行PCR扩增反应。
[0011]进一步的，所述深部感染曲霉菌的组合物还包括：如SEQ ID NO:10所示的内标上游引物；如SEQ ID NO:11所示的内标下游引物；以及如SEQ ID NO:12所示的内标探针。
[0012]所述深部感染曲霉菌的组合物中引物的用量为100～1000nM；所述深部感染曲霉菌的组合物中探针的用量为50～800nM。
[0013]所述PCR增强剂包括甜菜碱、DMSO以及甘油。
[0014]本专利技术所述深部感染曲霉菌的组合物中，探针的荧光基团彼此不互相干扰，在本专利技术中，“彼此不互相干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些荧光基团的吸光值不接近，能选择不同的检测通道，因而不会互相干扰。
[0015]进一步的，如SEQ ID NO:3所示的黄曲霉探针的荧光基团为FAM；如SEQ ID NO: 6所示的黑曲霉探针的荧光基团为HEX；如SEQ ID NO:9所示的烟曲霉探针的荧光基团为ROX；如SEQ ID NO:12所示的内标探针的荧光基团为CY5。
[0016]当本专利技术在制备快速检测深部感染曲霉菌的试剂盒时，所述试剂盒中可以包含核酸直裂提取液、dNTP(U)、DNA聚合酶、PCR缓冲液、UDG酶或Mg
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中的至少一种。
[0017]核酸直裂提取液是指能够纯化和提取能用于PCR的化学试剂。例如强酸性或强碱性的化学试剂。示例性的核酸直裂提取液可以是包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、十二烷基磺酸钠和蛋白酶等组分中的一种或几种，但本专利技术不限于此。
[0018]进一步的，当试剂盒中采用dNTP(U)时，dNTP(U)的用量为0.2～0.5mM。采用DNA聚合酶时，DNA聚合酶的浓度为5～20U/μL，例如DNA聚合酶可采用Taq DNA聚合酶。采用UDG酶时，UDG酶的浓度为0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测深部感染曲霉菌的方法，其特征在于：将待测样本与核酸直裂提取液混合后于60～65℃加热8～20min，再于93～98℃加热5～10min，获得待测样本的DNA提取液，将所述DNA提取液加入含有深部感染曲霉菌的组合物的PCR预混液中，制得PCR反应液，将所述PCR反应液进行以下PCR扩增反应：控制温度在90～100℃时，进行变性，停留时间为0～5s，控制温度在50～70℃时，进行退火延伸，停留时间为0～5s，循环35～50次，所述核酸直裂提取液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、十二烷基磺酸钠以及蛋白酶；所述PCR预混液还包括脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、扩增缓冲液以及PCR增强剂中的至少一种；所述深部感染曲霉菌的组合物包括以下组分：如SEQ ID NO:1所示的黄曲霉上游引物、如SEQ ID NO:2所示的黄曲霉下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的黄曲霉探针；如SEQ ID NO:4所示的黑曲霉上游引物、如SEQ ID NO:5所示的黑曲霉下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的黑曲霉探针；以及如SEQ ID NO:7所示的烟曲霉上游引物、如SEQ ID NO:8所示的烟曲霉下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的烟曲霉探针。2.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷成刚，张俊彦，崔岚，
申请(专利权)人：四川省三物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：