一种鉴定北高丛蓝莓品种的PCR试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种鉴定北高丛蓝莓品种的PCR试剂盒及其应用，属于分子标记开发及应用技术领域。本发明专利技术首次利用蓝莓品种德雷帕(Drapper)基因组数据，自主开发SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记，获得用于鉴定北高丛蓝莓品种的PCR试剂盒，所述的PCR试剂盒包括SSR引物组，即SSR160+SSR627+SSR1222，该引物组可以将48个北高丛蓝莓品种进行高效区分和鉴别，具有灵敏度高，经济、快速、操作简单等优点，可用于目前蓝莓市场常见及最新品种的鉴定，同时构建了48个品种的DNA指纹图谱，为解决蓝莓苗木市场品种鉴别问题提供重要的科学依据；同时对48个品种的遗传多样性进行了系统分析，为今后优化北高丛蓝莓育种组合，拓宽其遗传基础，具有重要的意义。具有重要的意义。具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定北高丛蓝莓品种的PCR试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于分子标记开发及应用
，具体涉及一种鉴定北高丛蓝莓品种的PCR试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]蓝莓(Blueberry)原产于北美洲，杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium L.)植物。由于其果实具有很高的营养价值，自20世纪初期被驯化栽培以来，已在世界范围内被广泛种植。近百年来，我国随着栽培技术不断提高，蓝莓产业发展迅猛，形成了东北地区、山东半岛、长江流域和云贵高原等4个主产区。
[0003]蓝莓栽培种根据树体大小和需冷量的多少可划分为北高丛蓝莓、南高丛蓝莓、半高丛蓝莓、矮丛蓝莓和兔眼蓝莓5个类型。蓝莓品种的正确识别和亲缘关系分析是蓝莓产业健康发展、科学开发及合理利用的重要前提，但我国蓝莓引种途径多，品种信息管理混乱；在生产过程中存在品种名音译、意译和自拟商品名同时存在的现象，导致种苗混乱，常出现以假乱真或以次充好的现象，使得蓝莓种植企业和种植户遭受重大经济损失。
[0004]传统的品种鉴别是基于蓝莓叶、花、果实和树姿进行的，但由于不同学者对形态性状的判断标准不一样，品种间性状交叉、重叠及在不同环境中具有很强的可塑性，造成此种鉴别方法准确度很低且非常困难，从而造成品种名混淆，同物异名、异物同名等鉴别错误的情况常常出现。
[0005]植物品种遗传多样性主要通过遗传标记的多态性来反映，分子标记是以核酸的多态性为基础的遗传标记。其不受组织类别、发育时期、环境条件等干扰，具有数量极多、多态性高等优点，是理想的遗传标记。分子标记已广泛应用于种质资源研究、杂种鉴定、遗传图谱构建、目的基因定位、遗传多样性、亲缘关系研究以及标记辅助选择育种。其中，微卫星(mirosatellite)，即简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)，是由2
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6个核甘酸串联重复片段构成的均匀分布于基因组中的简单重复序列；具有多态性高、稳定性好、多等位基因、共显性、数量丰富、基因组覆盖性好和操作简单等优点。已应用于中国李(Prunus salicina)、桃(Prunus persica)、黑果枸杞(Lycium ruthenicum)和枇杷(Eriobotrya japonica)等植物的亲缘关系、遗传多样性分析、品种指纹图谱绘制、品种鉴定和DNA指纹图谱构建等研究中。本研究组前期利用从Drapper基因组数据中开发出的2对SSR分子标记成功鉴定出12个蓝莓品种，仅仅利用两对引物就能鉴别12种蓝莓品种，已经取得了重大进步，但是蓝莓种类繁多，由于采用的引物数量较少，分辨率相对不足，仍有部分蓝莓品种无法区分开。

技术实现思路

[0006]为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种鉴定北高丛蓝莓品种的PCR试剂盒及其应用。针对目前北高丛蓝莓尚无高效的SSR标记的技术体系、品种尚待鉴定的现状，采集的常见的48个北高丛蓝莓品种材料进行遗传多样性研究，利用Drapper基
因组数据开发出的SSR标记以及筛选出的多态性引物，对这48个北高丛蓝莓品种进行鉴定，筛选最优的品种鉴定引物组合，并构建蓝莓品种SSR特征指纹，为蓝莓品种鉴定以及分子标记辅助育种提供重要依据。本专利技术包括两个内容：(1)3个SSR标记检测技术体系；(2)构建北高丛蓝莓品种的SSR分子指纹，用于有效鉴定品种的真实性。
[0007]本专利技术的目的通过以下方案实现：
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种蓝莓SSR分子标记引物组，所述的引物组包括3对SSR分子标记引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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6所示。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供一种鉴定北高丛蓝莓品种的PCR试剂盒，包括上述的蓝莓SSR分子标记引物组。
[0010]优选地，所述的PCR试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂和优化剂以及稳定剂、去离子水。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供一种鉴定北高丛蓝莓品种的方法，包括以下步骤：
[0012](1)提取已知品种的北高丛蓝莓的基因组DNA；
[0013](2)使用所述的引物对对步骤(1)所获基因组DNA进行PCR扩增；
[0014](3)使用聚丙烯酰胺凝胶电泳对步骤(2)所获PCR扩增产物进行检测，读取、分析数据；
[0015](4)构建北高丛蓝莓品种SSR特征指纹图谱；
[0016](5)采用步骤(1)～(3)获得待检测北高丛蓝莓品种的相应位点的扩增结果，若扩增结果与已知北高丛蓝莓品种指纹图谱中的碱基大小完全一致，即获得该未知北高丛蓝莓的品种。
[0017]优选地，所述的方法能够鉴定的品种包括大粒蓝金(Big gold)、早蓝(Earliblue)、维口(Weymouth)、爱国者(Patriot)、斯巴坦(Spartan)、蓝片(Bluechip)、蓝鸟(Bluejay)、蓝光(Blueray)、克瑞顿(Croaton)、伯克利(Berkeley)、蓝丰(Bluecrop)、蓝港(Blue Haven)、丹尼斯蓝(Denise Blue)、彭伯顿(Pemberton)、瑞卡(Reka)、塞拉(Sierra)、陶柔(Toro)、甜粒星(Amatsububoshi)、柏林顿(Burlington)、卡罗琳蓝(Caroline Blue)、泽西(Jersey)、莱格西(Legacy)、布里吉塔(Brigitta)、钱德勒(Chandler)、康维尔(Coville)、达柔(Darrow)、伊丽莎白(Elizabeth)、大粒星(Ootsububoshi)、埃利奥特(Elliott)、晚蓝(Lateblue)、鲁贝尔(Rubel)、卡拉(Cara's Choice)、汉纳(Hannah's Choice)、双迪(DⅡMSU54)、柳叶(Willow)、天益(NU59)、新爱绊(Ivanhoe 19)、流星(NU3)、香益(NU105)、甜心(Sweetheart)、卡蓝(Kabluey)、公爵(Duke)、自由(Liberty)、德雷珀(Draper、休伦(Huron)、丽宝
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蓝丝带(Blue Ribbon)、天宝
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顶层(Top Shelf)、尾声(Last Call)。
[0018]优选地，步骤(2)中的PCR扩增体系的体积为10μL，包含正反向引物(10μmol/L)各0.5μl、2*Taq PCR Master Mix 4μl、模板100ng，余量为去离子水。
[0019]优选地，步骤(2)中的PCR扩增程序为：94℃预变性6～10min；94℃变性35～40s，退火温度下退火30～70s，72℃延伸36s～2min，35～38个循环，72℃延伸10min。
[0020]优选地，SEQ ID NO.1
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2所示的分子标记引物对的退火温度为59℃；SEQ ID NO.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蓝莓SSR分子标记引物组，其特征在于，所述的引物组包括3对SSR分子标记引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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6所示。2.一种鉴定北高丛蓝莓品种的PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的蓝莓SSR分子标记引物组。3.根据权利要求2所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述的PCR试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂和优化剂以及稳定剂、去离子水。4.一种鉴定北高丛蓝莓品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取已知品种的北高丛蓝莓的基因组DNA；(2)使用权利要求1所述的引物对对步骤(1)所获的基因组DNA进行PCR扩增；(3)使用聚丙烯酰胺凝胶电泳对步骤(2)所获PCR扩增产物进行检测，读取、分析数据；(4)构建北高丛蓝莓品种SSR特征指纹图谱；(5)采用步骤(1)～(3)获得待检测北高丛蓝莓品种的相应位点的扩增结果，若扩增结果与已知北高丛蓝莓品种指纹图谱中的碱基大小完全一致，即获得该未知北高丛蓝莓的品种。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法能够鉴定的品种包括大粒蓝金(Big gold)、早蓝(Earliblue)、维口(Weymouth)、爱国者(Patriot)、斯巴坦(Spartan)、蓝片(Bluechip)、蓝鸟(Bluejay)、蓝光(Blueray)、克瑞顿(Croaton)、伯克利(Berkeley)、蓝丰(Bluecrop)、蓝港(Blue Haven)、丹尼斯蓝(Denise Blue)、彭伯顿(Pemberton)、瑞卡(Reka)、塞拉(Sierra)、陶柔(Toro)、甜粒星(Amatsububoshi)、柏林顿(Burlington)、卡罗琳蓝(Caroline Blue)、泽西(Jersey)、莱格西(Legacy)、布里吉塔(Brigitta)、钱德勒(Chandler)、康维尔(Coville)、达柔(Darrow)、伊丽莎白(Elizabeth)、大粒星(Ootsububoshi)、埃利奥特(Elliott)、晚蓝(Lateblue)、鲁贝尔(Rubel)、卡拉(Cara's Choice)、汉纳(Hannah...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐国辉，李逸斐，楚立威，温立柱，赵倩，崔青青，杜乾慧，王丽，刘桂婷，卢雅妮，邓艳琼，王贺新，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：