新型Cas酶和系统以及应用技术方案

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明专利技术提供了一种新型的Cas酶，所述Cas酶为Cas

【技术实现步骤摘要】
新型Cas酶和系统以及应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)
具体而言，本专利技术涉及一种新型的CRISPR酶(或者，称之为CRISPR蛋白、Cas效应蛋白、Cas酶或Cas蛋白)，包含此类蛋白的融合蛋白，以及编码它们的核酸分子。本专利技术还涉及用于核酸编辑(例如，基因或基因组编辑)的复合物和组合物，其包含本专利技术的Cas蛋白或融合蛋白，或编码它们的核酸分子。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
[0003]CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3
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NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5
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TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9,C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5
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TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。
[0004]总之，鉴于目前可获得的CRISPR/Cas系统都受限于一些缺陷，开发一种更稳健的、具有多方面良好性能的新型CRISPR/Cas系统对生物技术的发展具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现了一种新型核酸内切酶(Cas酶)。基于这一发现，本专利技术人开发了新的CRISPR/Cas系统以及基于该系统的基因编辑方法和核酸检测方法。
[0006]Cas效应蛋白
[0007]一方面，本专利技术提供了一种Cas蛋白，所述Cas蛋白是CRISPR/Cas系统中的效应蛋白，在本专利技术中，将其称为Cas
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sf9149(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)。
[0008]在一个实施方式中，所述Cas蛋白氨基酸序列与SEQ ID No.1相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能。优选的，所述Cas蛋白与Cas
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sf9149来源于同一物种。
[0009]在一个实施方式中，所述Cas蛋白氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；所述一
氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在上述Cas蛋白的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。
[0017]表1
[0018]最初的残基代表性的取代优选的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu
[0019]本领域熟知，可以从蛋白质的N和/或C末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从Cas蛋白的N和/或C末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本专利技术的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如PCR而引入的改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。
[0020]应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备上述蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
[0021]本领域技术人员能够理解，本专利技术Cas蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r
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DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些
突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。
[0022]本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定本专利技术Cas蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。
[0023]在一个实施方式中，所述Cas蛋白含有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
[0024]在一个实施方式中，所述Cas蛋白为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
[0025]在一个实施方式中，所述Cas蛋白是与具有SEQ ID No.1所示的序列的蛋白质相同生物学功能的衍生化蛋白。
[0026]所述生物学功能包括但不限于，与指导RNA结合的活性、核酸内切酶活性、在指导RNA引导下与靶序列特定位点结合并切割的活性，包括但本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Cas蛋白，其特征在于，所述Cas蛋白为以下I
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III任一所述的Cas蛋白：I、Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；II、所述Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有一个或多个氨基酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸)的置换、缺失或添加的序列，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；III、所述Cas蛋白包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的Cas蛋白，其特征在于，所述Cas蛋白氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第8位、第167位、第178位、第235位、第271位、第382位、第476位、第504位、第602位、第804位、第861位。3.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1或2所述的Cas蛋白和其他的修饰部分。4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1或2所述Cas蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求3所述融合蛋白的多核苷酸序列。5.一种gRNA，其特征在于，所述gRNA包括能够结合权利要求1或2所述的Cas蛋白的同向重复序列和能够靶向靶序列的引导序列。6.一种同向重复序列，其特征在于，所述同向重复序列包含SEQ ID No.4所示的序列。7.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求4所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。8.一种CRISPR
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Cas系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1或2所述的Cas蛋白以及至少一种权利要求5所述的gRNA。9.一种载体系统，其特征在于，所述载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：a)第一调控元件，该第一调控元件可操作地与权利要求5所述的gRNA连接，b)第二调控元件，该第二调控元件可操作地与权利要求1或2所述的Cas蛋白连接；其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上。10.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：(i)蛋白组分，其选自：权利要求1或2所述的Cas蛋白或权利要求3所述的融合蛋白；(ii)核酸组分，其选自：权利要求5所述的gRNA，或编码权利要求5所述的gRNA的核酸，或权利要求5所述的gRNA的前体RNA，或编码权利要求5所述的gRNA的前体RNA核酸；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。11.一种活化的CRISPR复合物，所述活化的CRISPR复合物包含：(i)蛋白组分，其选自：权利要求1或2所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白；(ii)核酸组分，其选自：权利要求5所述的gRNA，或编码权利要求5所述的gRNA的核酸，或权利要求5所述的gRNA的前体RNA，或编码权利要求5所述的gRNA的前体RNA核酸；(iii)结合在权利要求5所述的gRNA上的靶序列。
12.一种工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1或2所述的Cas蛋白，或权利要求3所述的融合蛋白，或权利要求4所述的多核苷酸，或权利要求7所述的载体，或权利要求8所述的CRISPR
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Cas系统，或权利要求9所述的载体系统，或权利要求10所述的组合物，或权利要求11所述的活化的CRIS...

【专利技术属性】
技术研发人员：李珊珊，段志强，孙洁，赵庆芝，刘锐恒，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：