一种非限制性核酸内切酶突变体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种非限制性核酸内切酶突变体及其制备方法。本发明专利技术的一种非限制性核酸内切酶突变体，在野生型非限制性核酸内切酶氨酸酸序列上进行六个氨基酸位点的突变获得，六个氨基酸突变位点为：R65V、N66A、W67F、E135G、D136T、Q137I，所述的非限制性核酸内切酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过突变关键位点的氨基酸带电荷或疏水性的改变，从而改变核酸内切酶的空间结构，提高非限制性核酸内切酶的表达效率和活性。制性核酸内切酶的表达效率和活性。制性核酸内切酶的表达效率和活性。

【技术实现步骤摘要】
一种非限制性核酸内切酶突变体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物酶
，涉及一种非限制性核酸内切酶突变体及其制备方法，具体涉及一种具有分泌表达、高活性的核酸内切酶突变体的构建和应用。

技术介绍

[0002]非特异性核酸内切酶是一类能够降解各种形式DNA和RNA的水解酶，对单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA的磷酸二酯键均具有很高的活性，产生5
’‑
磷酸核苷酸或5
’‑
磷酸寡核苷酸，且对核酸没有序列要求。可用于除去生物材料中的核酸或排除由核酸引起的干扰。
[0003]这类酶的典型代表是来源于Serratia marcescens的非特异性核酸内切酶，已经商品化，商品名该酶的基因已被克隆和在大肠杆菌中表达，由于该酶具有信号肽，生成的核酸酶被分泌到周质和培养基等不同部位。到目前为止，该酶主要是从培养基中分离纯化都得到的。但是，只有少量的酶被分泌到胞外，还有不少在周质和以无活性的前体包涵体形式存在于胞内。有人将包涵体增溶和复性，虽得到了具有活性的酶，但由于是前体蛋白，有一段信号肽，所以比活不高。因此，该酶的产量较低，工艺繁琐，价格偏贵，不利用于在我国使用。所以如何构建和制备一种新型的非特异性核酸内切酶，使非特异性核酸内切酶能够高效分泌表达和活性提高，是本行业研究的热点和难点。
[0004]本专利技术通过点突变和密码子优化，成功获得了高效分泌表达，且活性高的非特异性核酸内切酶突变体，显著提高了该酶的产量并简化了工艺。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术中出现的问题，本专利技术提供了一种分泌水平高的非限制性核酸内切酶突变体及其制备方法。
[0006][0007]为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术的一种非限制性核酸内切酶突变体，在野生型非限制性核酸内切酶氨酸酸序列上进行六个氨基酸位点的突变获得，六个氨基酸突变位点为：R65V、N66A、W67F、E135G、D136T、Q137I，所述的非限制性核酸内切酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术编码所述的非限制性核酸内切酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术包含所述基因的重组表达载体。
[0010]本专利技术的一株大肠杆菌表达菌，含有所述的重组表达载体。
[0011]本专利技术所述的非限制性核酸内切酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
[0012](1)获得编码权利要求1所述的非限制性核酸内切酶突变体的基因；
[0013](2)重组表达载体pCold
‑
Nse
‑
mut的构建
[0014]首先，将表达载体pCold
‑
I经限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切处理，得到线性
化的pCold
‑
I载体；然后，将步骤(1)获得的序列利用非连接酶依赖型单片段快速克隆连入线性化的pCold
‑
I载体中，制得重组表达载体pCold
‑
Nse
‑
mut；
[0015](3)重组菌Nse
‑
mut/BL21的构建
[0016]将重组表达载体pCold
‑
Nse
‑
mut转化BL21感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的LB琼脂平板进行培养，挑选阳性重组菌，命名为Nse
‑
mut/BL21；
[0017](4)诱导表达过夜涂板活化重组菌Nse
‑
mut/BL21，取诱导后的重组菌液，离心，弃上清，加入PBS重悬菌体并进行超声处理，然后加入5
×
SDS样品裂解液，沸水浴10min，离心，取上清，将重组融合蛋白经His
‑
tag标签亲和纯化，制得非限制性核酸内切酶突变体。
[0018]进一步地，在步骤(2)中，用于扩增所述的非限制性核酸内切酶突变体的基因的引物：引物Nse
‑
mut
‑
F具有SEQ ID NO.3的核苷酸序列；引物Nse
‑
mut
‑
R具有SEQ ID NO.4的核苷酸序列。
[0019]进一步地，在步骤(4)中，挑取单菌落接种于含浓度为100μg/ml氨苄的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；取新培养菌液按体积比1:10比例转接至含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃培养至OD600 0.4
‑
0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，16℃诱导24h，制得诱导后的重组菌液。
[0020]本专利技术所述的非限制性核酸内切酶突变体或所述的基因或所述的重组表达载体在核酸酶切反应中的应用。
[0021]有益效果：本专利技术通过突变关键位点的氨基酸带电荷或疏水性的改变，从而改变核酸内切酶的空间结构，提高非限制性核酸内切酶的表达效率和活性。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
[0023](1)本专利技术新型的非限制性核酸内切酶突变体及其编码基因序列，并基因工程方法制备了该非限制性核酸内切酶突变体，满足了市场上对于非限制性核酸内切酶的需求。
[0024](2)试验显示本专利技术公开的一种非限制性核酸内切酶突变体的分泌表达水平明显优异野生型。试验显示本专利技术公开的一种非限制性核酸内切酶突变体的酶比活明显优异野生型。本专利技术为降低核酸内切酶的使用成本，提供了解决方案。
附图说明
[0025]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0026]图1为本专利技术的非限制性核酸内切酶突变体序列设计图；
[0027]图2为本专利技术的核酸内切酶突变体PCR扩增结果图；
[0028]M：DNA Marker DL1000；1
‑
4：PCR产物；5：阴性对照；
[0029]图3为本专利技术的重组菌Nse
‑
mut/BL21 PCR的鉴定结果图；
[0030]M：DNA Marker DL1000；1
‑
5：重组菌Nse
‑
mut/BL21的PCR扩增结果；6：阴性对照；
[0031]图4为本专利技术的核酸内切酶突变体蛋白纯化PAGE胶图；
[0032]M：蛋白Marker；1
‑
2：Nse
‑
mut/BL21
‑
1号菌；3
‑
4：Nse
‑
mut/BL21
‑
1号菌。
具体实施方式
[0033]下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术
人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非限制性核酸内切酶突变体，其特征在于：在野生型非限制性核酸内切酶氨酸酸序列上进行六个氨基酸位点的突变获得，六个氨基酸突变位点为：R65V、N66A、W67F、E135G、D136T、Q137I，所述的非限制性核酸内切酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述的非限制性核酸内切酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.包含权利要求2所述基因的重组表达载体。4.一株大肠杆菌表达菌，其特征在于：含有权利要求3所述的重组表达载体。5.权利要求1所述的非限制性核酸内切酶突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)获得编码权利要求1所述的非限制性核酸内切酶突变体的基因；(2)重组表达载体pCold
‑
Nse
‑
mut的构建首先，将表达载体pCold
‑
I经限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切处理，得到线性化的pCold
‑
I载体；然后，将步骤(1)获得的序列利用非连接酶依赖型单片段快速克隆连入线性化的pCold
‑
I载体中，制得重组表达载体pCold
‑
Nse
‑
mut；(3)重组菌Nse
‑
mut/BL21的构建将重组表达载体pCold
‑
Nse
‑
mut转化BL21感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的LB琼...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨洋，汪寄宇，
申请(专利权)人：上海拜朗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：