编辑活性提高的Cas蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明专利技术提供了一种Cas突变蛋白，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白相比，显著的提高了编辑活性，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
编辑活性提高的Cas蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)
具体而言，本专利技术涉及一种编辑活性提高的Cas蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
[0003]CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3
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NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5
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TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9,C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5
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TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。
[0004]中国专利技术专利申请CN114672473A中公开了一种氨基酸产生突变的Cas蛋白，还公开了该蛋白可以在真核细胞中进行基因编辑，本申请通过蛋白进化，进一步提高了该蛋白在真核细胞中的编辑范围，扩展了其应用范围。

技术实现思路

[0005]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，通过对Cas蛋白的定点突变和优化组合，提高了其编辑活性，扩展了其应用范围。
[0006]Cas效应蛋白
[0007]一方面，本专利技术提供了一种编辑活性提高的Cas突变蛋白，所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第233位、第267位、第369位、第433位、第168位、第328位、第505位。
[0008]在一个实施方式中，所述编辑活性提高的Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第233位、第267位、第369位、第433位、第168位、第328位、第505位；所述任意几个选自：任意2个、任意3个、任意4个、任意5个、任意6个或7个。
[0009]在优选的实施方式中，所述编辑活性提高的Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：
[0010]第168位氨基酸；
[0011]或，第233位氨基酸；
[0012]或，第168位氨基酸和第267位氨基酸同时突变；
[0013]或，第168位氨基酸和第505位氨基酸同时突变；
[0014]或，第233位氨基酸和第267位氨基酸同时突变；
[0015]或，第233位氨基酸和第505位氨基酸同时突变；
[0016]或，第233位氨基酸、第369位氨基酸和第433位氨基酸同时突变；
[0017]或，第233位氨基酸、第267位氨基酸、第328位氨基酸和第369位氨基酸同时突变；
[0018]或，第233位氨基酸、第267位氨基酸、第369位氨基酸和第433位氨基酸同时突变；
[0019]或，第168位氨基酸、第267位氨基酸、第328位氨基酸和第369位氨基酸同时突变。
[0020]在一个实施方式中，所述第168位氨基酸突变为非N的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，突变为R。
[0021]在一个实施方式中，所述第233位氨基酸或第267位氨基酸突变为非D的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，N，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，所述第233位氨基酸或第267位氨基酸突变为R。
[0022]在一个实施方式中，所述第328位氨基酸突变为非K的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，S，E，N，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0023]在一个实施方式中，所述第369位氨基酸突变为非N的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0024]在一个实施方式中，第433位氨基酸突变为非S的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0025]在一个实施方式中，所述第505位氨基酸突变为非T的氨基酸，例如，A，V，G，L，D，F，W，Y，N，S，Q，E，M，K，C，P，H，R，I；优选，突变为R。
[0026]在一个实施方式中，所述亲本Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。
[0027]在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白选自以下I
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III任意一组：
[0028]I、由SEQ ID No.1所示氨基酸序列在包含以下任一或任意几个氨基酸位点处产生突变得到的Cas突变蛋白：第233位、第267位、第369位、第433位、第168位、第328位、第505位；
[0029]II、与I所述的Cas突变蛋白相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的Cas突变蛋白相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性的Cas突变蛋白；
[0030]III、与I所述的Cas突变蛋白相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的Cas突变蛋白相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加。
[0031]在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白选自以下I
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III任意一组：
[0032]I、由SEQ ID No.1所示氨基酸序列在包含以下任一或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Cas突变蛋白，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第233位、第267位、第369位、第433位、第168位、第328位、第505位。2.根据权利要求1所述的Cas突变蛋白，其特征在于，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：第233位氨基酸发生突变；或，第233位氨基酸和第267位氨基酸同时突变；或，第233位氨基酸、第369位氨基酸和第433位氨基酸同时突变；或，第233位氨基酸、第267位氨基酸、第369位氨基酸和第433位氨基酸同时突变；或，第233位氨基酸和第505位氨基酸同时突变；或，第233位氨基酸、第267位氨基酸、第328位氨基酸和第369位氨基酸同时突变；或，第168位氨基酸发生突变；或，第168位氨基酸和第267位氨基酸同时突变；或，第168位氨基酸和第505位氨基酸同时突变；或，第168位氨基酸、第267位氨基酸、第328位氨基酸和第369位氨基酸同时突变。3.根据权利要求1或2所述的Cas突变蛋白，其特征在于，所述Cas突变蛋白选自以下i
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iii任意一组：i、由SEQ ID No.1所示氨基酸序列在包含以下任一或任意几个氨基酸位点处产生突变得到的Cas突变蛋白：第233位、第267位、第369位、第433位、第168位、第328位、第505位；ii、与I所述的Cas突变蛋白相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的Cas突变蛋白相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性的Cas突变蛋白；iii、与I所述的Cas突变蛋白相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的Cas突变蛋白相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加。4.根据权利要求1或2所述的Cas突变蛋白，其特征在于，所述Cas突变蛋白选自以下I
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III任意一组：I、由SEQ ID No.1所示氨基酸序列在包含以下任一或任意几个氨基酸位点处产生突变得到的Cas突变蛋白：第233位、第267位、第369位、第433位、第168位、第328位、第505位；并且，所述Cas突变蛋白在对应于SEQ ID No.1的第7位、第233位、第267位、第369位、第433位、第168位、第328位或第505位的任一或任意几个氨基酸位点为精氨酸(R)；II、与I所述的Cas突变蛋白相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性的Cas突变蛋白；并且，所述Cas突变蛋白在对应于SEQ ID No.1的第7位、第233位、第267位、第369位、第433位、第168位、第328位或第505位的任一或任意几个氨基酸位点为精氨酸(R)；
III、与I所述的Cas突变蛋白相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加；并且，所述Cas突变蛋白在对应于SEQ ID No.1的第7位、第233位、第267位、第369位、第433位、第168位、第328位或第505位的任一或任意几个氨基酸位点为精氨酸(R)。5.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1
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4任一所述的Cas突变蛋白以及其他的修饰部分。6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1
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4任一所述Cas突变蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求5所述融合蛋白的多核苷酸序列。7.一种载体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁亚峰，段志强，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：